Методы создания рекомбинантных ДНК

1. Расщепление ДНК рестриктазами.В качестве мишеней рестриктаз выступают палиндромы из 4-6 пар оснований. Это сайты рестрикции. Одни рестриктазы вносят разрывы по оси симметрии, и образуются «тупые» концы», другие – со сдвигом, образуются «липкие» концы (фрагменты имеют на концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в 4 нуклеотида). Полученные фрагменты используют для создания рекомбинантных ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. Фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, отделяют электрофорезом и исследуют каждый из них отдельно. Строят рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК. Плазмиды выделяют из E.coli и удаляют из них часть кольцевой молекулы ДНК с помощью рестриктаз. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в разных местах, в результате образуются «липкие» концы. На фрагменте ДНК, выбранном для пересадки, создают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать фрагмент ДНК (ген) и плазмиду, то они соединяются «липкими» концами. Далее с помощью лигаз вновь получают кольцевую молекулу ДНК, которая вместе с плазмидной ДНК содержит ген, выбранный для пересадки. Это рекомбинантная ДНК.

- сшивка по одноименным «липким» концам (рестриктазно-лигазный метод) – комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований; для восстановления разрывов используют ДНК-лигазу;

- сшивка по «тупым» концам (коннекторный метод) – тупые концы соединяют ДНК-лигазой, при этом эффективность реакции меньше, чем при сшивке «липкими» концами;

- сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами – применяют линкеры, т.е. химически синтезированные олигорибонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию (существуют линкеры «тупой конец – липкий конец»); так получают очень небольшие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной ДНК:

- клонирование ДНК in vivo: к культуре E.coli добавляют рекомбинантные плазмиды, которые включаются в бактериальные клетки, и получают рекомбинантные буктерии. Плазмиды в клетке начинают реплицироваться. При размножении бактерий вновь образующиеся бактериальные клетки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных бактерий выделяют клонированные рекомбинантные плазмиды, а из них – исследуемый фрагмент ДНК. Так выделяют ген или любой фрагмент ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей;

- аплификация (увеличение числа копий) ДНК in vitro: в 1985 г. К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, получивший название полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических праймера. Праймеры ориентированы так, чтобы синтез с помощью полимеразы протекал только между ними. Тем самым происходит удвоение копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок называют «ампликоном». Амплификация заключается в повторяющихся циклах и является трехступенчатым процессом: 1 – денатурация ДНК при 95 °С; 2 – отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 °С); 3 – достройка полинуклеотидных цепей от праймеров с помощью ДНК-полимеразы при 70-75 °С. Продолжительность указанного цикла – менее 3 минут. Т.е., за 2 часа получают около миллиарда копий определяемой последовательности ДНК.

Применение ПЦРв медицинской практике – диагностические тесты на генетические и инфекционные заболевания (в частности, для ранней диагностики ВИЧ); для анализа индивидуальных сперматозоидов и пр.

5. Введение гена в клетку.

Ген водят двумя способами так, чтобы он не был разрушен клеточными нуклеазами, и интегрировался с геномом клетки.

1 способ. Трансдукция.

Вектор, молекула ДНК или РНК, состоящая из векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-реципиент и встроить ее в геном. В состав вектора входит маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Выделяют 2 группы маркерных генов: селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам; репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях легко тестируется. За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые встраивают в каждую векторную молекулу. Для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены контролировались прокариотическими регуляторными элементами.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды – наиболее часто используемая для клонирования плазмида pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E.coli;

- вирусы – есть вирусы, не ведущие к гибели клетки, но встраивающиеся в геном клетки-хозяина, и размножающиеся вместе с ней, либо вызывающие ее неконтролируемый рост (превращение в раковую);

- гибридные векторы – содержат ДНК фага и плазмиды: космиды и фазмиды.

2 способ. Трансформация (прямое введение гена в клетку):

- трансфекция: ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция, которые поглощаются клеткой путем фагоцитоза;

- микроинъекции ДНК микропипетками и микроманипулятором;

- электропорация – импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран;

- «мини-клетки», получаемые блокированием донорных клеток в митозе колцемидом. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются микроядра («мини-клетки»), инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия;

- упаковка в лизосомы – защита экзогенного генетического материала от действия рестриктаз;

- метод биолистики – один из самых эффективных методов трансформации растений: на частички вольфрама напыляются ДНК-векторы. Частички помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии стало возможным заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно: интерферон, инсулин, соматостатин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др.

Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать механизмы регуляции экспрессии генов и модифицировать генетический аппарат клетки.

Генотерапия – лечения заболеваний с помощью генов. Существует два типа генотерапии:

- заместительная генотерапия: в клетку вводят неповрежденный ген;

- корректирующая генотерапия: дефектный ген заменяют нормальным в результате рекомбинации.

Генотерапию используют для коррекции нарушений при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшена (заболевание мальчиков, связанное с дефектом Х-хромосомы): нормальный ген, кодирующий белок дистрофии, вкалывают в мышечные волокна, используя либо «голую» ДНК, либо аденовирусный вектор, и ребенок приобретает способность двигаться. Однако пока удалось получить только временный терапевтический эффект, и поэтому процедура введения гена должна повторяться неоднократно.

Муковисцидоз – наследственное заболевание легких, поражающее в Центральной Европе одного новорожденного из 2500. Для него установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление этого гена – пневмония. Поражаются все эпителиальные клетки. Неповрежденную копию гена, включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути больного.

Генотерапия применима не только к наследственным заболеваниям. Предстоит решить проблему лечения генами СПИДа. ВИЧ – ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы победить, если бы были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало бы дальнейшее размножение вируса.

Получение трансгенных животных. Для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток, которые передадут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений. Микроинъекцию клонированных генов производят в оплодотворенную яйцеклетку, затем ее имплантируют в яйцевод приемной матери. Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение.

В Англии созданы трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови. Создан трансгенный крупный рогатый скот, в молоке которого содержится человеческий альбумин: каждая корова производит до 80 кг рекомбинантного человеческого альбумина в год.

Трансгенных животных получают для трансплантации органов. Лучшие доноры органов – свиньи, т.к. имеется анатомическое сходство органов и иммунологическийх свойств. Реакции отторжения органов при трансплантации имеют сложный механизм, и одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на внешней поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки заменены на человеческие.