Получение рекомбинантных ДНК

Технологию рекомбинантных ДНК можно использовать для манипуляций с фрагментами ДНК, выделенными из живых организмов или синтезированными искусственно. Эта технология позволяет также вносить определенные изменения в структуру естественных генов и их регуляторных элементов, комбинировать их в произвольной последовательности. Для того чтобы проводить названные манипуляции, необходимо иметь возможность разрезать молекулы ДНК на отдельные определенные фрагменты, а затем сшивать их в нужном сочетании. Для реализации первой из названных задач используют наборы ферментов - рестриктаз.

Первые рестриктазы, пригодные для генно-инженерных целей, были выделены в 1970 году Г.Смитом (США), обнаружившим, что бактерия Haemophillus influenzae быстро расщепляет ДНК фагов. В ходе исследований, проведенных им, было показано, что нуклеазная активность (способность разрезать молекулы нуклеиновых кислот ДНК и РНК), характерная для живых бактерий, сохраняется и в бесклеточном экстракте, полученном из них. Выяснилось, что нуклеазная активность обусловлена присутствием в экстракте фермента-рестриктазы, получившего название HindII. Было установлено, что выделенный и очищенный фермент способен узнавать последовательности нуклеотидов ГТПи↓ПуАЦ

ЦАПу↑ПиТГ ,

(где Пи- любое пиримидиновое основание, а Пу – пуриновое основание) и проводить расщепление молекулы ДНК (место расщепления указано стрелками). Интересно, что рестриктаза HindII способна разрезать ДНК из различных источников, в том числе хорошо известной бактерии Escherichia coli (E. coli), но при этом не повреждает ДНК бактерии, из которой она была выделена.

В дальнейшем было выделено несколько сотен рестриктаз из разных бактерий, способных узнавать и расщеплять специфические последовательности нуклеотидов (сайты узнавания) в молекуле ДНК. Некоторые из этих ферментов узнают группы из четырех нуклеотидов, другие - из шести и даже более нуклеотидов. Естественно, рестриктазы, распознающие группы из четырех нуклеотидов, вносят в молекулу ДНК, выделенную из какого-либо организма, больше разрывов, чем те, которые узнают шесть и более нуклеотидов.

Для целей генной инженерии наибольшее значение имело выделение рестриктаз, которые дают фрагменты с так называемыми липкими (комплементарными) концами. В случае их использования разрывы ДНК происходят в местах, расположенных наискось: на концах каждого из полученных фрагментов остаются короткие одноцепочечные «хвосты» из нескольких нуклеотидов (таблица 9.1). Если объединить в одной пробирке фрагменты ДНК любого происхождения, полученные с помощью одной и той же рестриктазы, дающей липкие концы, то эти фрагменты соединятся между собой. Однако водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями не достаточно прочны, чтобы стабильно удерживать два объединенных фрагмента ДНК. Для воссоединения фосфодиэфирных связей между концами сшиваемых фрагментов ДНК необходим фермент ДНК-лигаза. Этот фермент был впервые выделен в 1967 году из культуры E. coli, инфицированной бактериофагом Т4, при изучении энзимологии процесса репликации ДНК (то есть еще до того, как научились разрезать ДНК).

Для генной инженерии большое значение имеет использование еще одного фермента – концевой трансферазы из тимуса теленка, который катализирует присоединение нуклеотидов к 3’-концам цепей ДНК. Благодаря этому из «тупого» конца ДНК несложно сделать липкий. Если к обоим 3’-концам двухцепочечного фрагмента присоединить несколько расположенных друг за другом адениновых нуклеотидов (поли-А), а к другому фрагменту ДНК присоединить – поли-Т, то при смешивании этих двух фрагментов они соединятся между собой, поскольку их концы комплементарны друг другу (рисунок 9.1).

В генно-инженерных работах часто используют еще один метод произвольного сшивания фрагментов ДНК, основанный на применении так называемых линкеров – искусственных сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой короткие фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), состоящие из 8-10 нуклеотидных пар. Их синтезируют искусственно. При этом состав и последовательность нуклеотидов в них соответствует сайту рестрикции одной из рестриктаз, образующей липкие концы, и которая была использована при выделении фрагмента ДНК, который предполагается пришить к какому-то определенному фрагменту ДНК. Линкеры пришивают к этому последнему фрагменту ДНК с помощью концевой трансферазы и ДНК-лигазы, а затем расщепляют их рестриктазой. В результате этот фрагмент приобретает липкий конец нужной нам конфигурации (рисунок 9.2). Линкеры, имеющие несколько сайтов узнавания рестриктазами, называются полилинкерами.

Одна какая-либо рестриктаза вносит строго определенное количество разрывов в определенных местах молекулы ДНК какого-либо анализируемого организма. В этом можно убедиться, если образовавшиеся после обработки ферментом фрагменты ДНК разделить с помощью гель-электрофореза.

Принцип этого распространенного аналитического метода, который используют для исследования белков и нуклеиновых кислот, заключается в следующем. Компоненты смеси разделяют путем пропускания ее через гель – полужидкую среду с сетчатой пространственной структурой, которую получают путем полимеризации агара, агарозы, сополимеризации акриламида и бисакриламида и др. Обычно гели готовят в виде тонких пластинок, имеющих у одного края лунки для нанесения препарата. Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают электрическим зарядом. Когда через гель с нанесенным раствором пропускают электрический ток, то компоненты смеси начинают перемещаться в электрическом поле. Фрагменты ДНК или отдельные протеины, содержащиеся в анализируемой смеси, имеют разную длину, а, следовательно, и размеры. Скорость миграции компонентов смеси в геле пропорциональна их размерам: более мелкие фрагменты будут перемещаться быстрее. В результате по окончании электрофореза, когда наиболее быстрые компоненты смеси достигнут противоположного края гелевой пластинки, остальные равномерно распределятся по ее длине в соответствии со своими размерами. После их окрашивания специальными красителями можно наблюдать на геле спектр четко различимых полос, расположенных одна за другой, каждая из которых соответствует отдельному компоненту смеси.

Электрофоретические спектры рестрикционных фрагментов для какой-либо рестриктазы и для ДНК какого-либо организма строго специфичны. Сколько бы раз ни выделяли ДНК, сколько бы раз ни обрабатывали ее рестриктазой, в любом случае при электрофорезе мы получим один и тот же спектр, состоящий из определенного количества специфических полос. На основании этого правила строят так называемые рестрикционные карты молекул ДНК, на которые наносят в установленной последовательности сайты рестрикции различных рестриктаз. Такие карты используют в молекулярной генетике для характеристики отдельных ДНК и в генной инженерии для подбора рестриктаз при выделении отдельных генов.

Исключительно важной особенностью электрофоретического разделения рестрикционных фрагментов ДНК является то, что при электрофорезе эти фрагменты не разрушаются и их можно выделить (элюировать) из геля в виде биологически активных двухцепочечных молекул. Фрагменты ДНК, выделенные из одной какой-либо полосы, будут строго идентичны друг другу. Их далее можно анализировать на предмет определения последовательности нуклеотидов, использовать в качестве материала для построения генетических конструкций и т.д.

Объединение разных молекул ДНК с помощью методов, описанных выше, само по себе бесполезно, если полученные рекомбинантные ДНК не внести в живую клетку, не заставить их там реплицироваться, и, что самое важное, заставить привнесенные гены работать: синтезировать мРНК, транслировать ее в рибосомах с образованием протеина – продукта трансгена.

Первая функционально активная молекула рекомбинантной ДНК была получена в 1973 году. Г. Бойер и С. Коэн (США) сумели соединить фрагменты ДНК плазмид разных бактерий, полученных путем их разрезания рестриктазой, дающей липкие концы, и ввели ее в E. сoli. Они обнаружили, что такая химерная плазмида могла успешно функционировать, реплицироваться и передаваться потомству как естественным путем, так и с помощью человека [Cohen et al., 1973]. Это означало, что таким образом можно получать многочисленные копии любых генов, то есть клонировать гены, нарабатывать достаточные объемы генетического материала для последующего изучения и возможных манипуляций с ними.

Выбор плазмиды американскими учеными в качестве вектора клонирования оказался весьма удачным. Именно плазмидные векторы в настоящее время используют в генетической инженерии чаще всего. То же относится к бактерии E. сoli, которую чаще всего используют в качестве «места» клонирования. Попытаемся разобраться, что лежит в основе их успеха.

Для того чтобы рекомбинантная ДНК имела возможность реплицироваться в живой клетке, она должна содержать ту часть естественной молекулы ДНК, которая ответственна за начало, инициацию этого процесса. Вероятность того, что она окажется в случайных рестрикционных фрагментах ДНК ничтожна. В то же время сайт начала репликации имеется в любой бактериальной плазмиде (его обозначают как ori). Поэтому, если в плазмиду встроить нужный фрагмент ДНК, она обеспечит репликацию как своей собственной ДНК, так и встроенного фрагмента.

Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирующиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Они присутствуют в клетках практически всех бактерий. Размеры плазмид от менее 1 до более 500 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.). Они могут быть представлены в клетке одной, несколькими, или многими (10-100) копиями. На их долю приходится до 5% суммарной клеточной ДНК. Малокопийные плазмиды реплицируются с той же скоростью, что и бактериальная хромосома, многокопийные плазмиды способны реплицироваться независимо.

Функции плазмид весьма разнообразны. Есть плазмиды, так называемые F-факторы (F-плазмиды), которые отвечают за прохождение полового процесса у бактерий (конъюгацию), при котором осуществляется перенос плазмид из одной бактериальной клетки в другую, а также части генетической информации, находящейся на бактериальной хромосоме. Имеются плазмиды, которые определяют устойчивость бактерий к антибиотикам (R-плазмиды), или их способность утилизировать, перерабатывать необычные вещества, например, нефтепродукты, пестициды и другие загрязнители окружающей среды (плазмиды деградации). Расположение таких генов именно на плазмидах, а не на хромосоме неслучайно. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке возможность синтеза большого количества ферментов, способных нейтрализовать антибиотики или расщеплять пестициды.

Некоторые плазмиды, называемые эписомами, могут обратимо включаться в бактериальную хромосому (к ним относятся упомянутые выше F-факторы). Если две плазмиды не могут сосуществовать в одной клетке, то их относят к одной группе несовместимости. Плазмиды из разных групп несовместимости могут находиться в одной клетке независимо от числа копий. Отмечены случаи, когда у бактерий обнаруживали до 8-10 разных групп плазмид, выполняющих свои функции, и представленных характерным для каждой группы числом копий.

Плазмиды могут передаваться от одной бактериальной клетки к другой, в том числе и неродственной. Чтобы интенсифицировать процесс внедрения плазмид в бактериальные клетки в экспериментах используют специальные приемы. Например, подвергают клетки высокотемпературному воздействию и обрабатывают их хлористым кальцием (CaCl₂).

Каждая плазмида обязательно содержит сайт инициации репликации (ori). Однако у одних он строго специфичен, то есть плазмиды с таким сайтом способны реплицироваться только в клетках одного вида бактерий. У других плазмид этот сайт менее специфичен, и они способны реплицироваться в самых разных бактериальных клетках. Соответственно различают плазмиды с узким и широким спектром хозяев. Существование последней группы плазмид имеет, можно сказать, зловещее значение, поскольку лежит в основе быстрой передачи генов устойчивости к антибиотикам к ранее чувствительным к ним болезнетворным микроорганизмам.

В качестве векторов клонирования используют специально отобранные и генетически модифицированные плазмиды. Основные требования к вектору следующие: 1) небольшой размер, поскольку эффективность клонирования чужеродной ДНК в E. сoli значительно снижается при общей длине привнесенной рекомбинантной плазмиды более 15 т.п.н.; 2) наличие уникального сайта рестрикции, в который может быть осуществлена вставка; 3) наличие одного или нескольких селективных генетических маркеров для идентификации трансформированных клеток (то есть включивших привнесенные гены). В качестве последних чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам.

Процедура клонирования фрагментов ДНК осуществляется следующим образом. Первый этап включает разрезание кольцевой молекулы ДНК плазмиды, которую используют в качестве вектора клонирования. Плазмида, как правило, содержит два маркерных гена, например, гены устойчивости к двум разным антибиотикам. Обычно место расщепления плазмидной ДНК находится в пределах структурной последовательности одного из ее маркерных генов. Такой же самой рестриктазой, образующей липкие концы, разрезают ДНК, фрагменты которой предполагается клонировать (донорной ДНК), и смешивают с разрезанной плазмидной ДНК. Поскольку липкие концы этих двух ДНК взаимно комплементарны, они соединяются с образованием гибридных молекул. Процесс сшивки закрепляют путем добавления в раствор фермента ДНК-лигазы. В результате образуется смесь разных комбинаций плазмидной и донорной ДНК, а также такие нежелательные продукты, как слившиеся фрагменты только донорной ДНК или восстановленные кольцевые молекулы плазмидной ДНК (рисунок 9.4).

Рекомбинантные плазмиды, содержащие встроенные фрагменты донорной ДНК далее вводят в клетку-хозяина, обычно это - E. сoli. Для этого бактерии смешивают с раствором плазмид, в который добавляют хлористый кальций, подвергают клетки нагреванию. Тем не менее, эффективность трансформации (внедрения чужеродной ДНК в клетку) остается невысокой: порядка одной клетки на тысячу. Что получается в результате? Большинство бактериальных клеток остаются интактными. Небольшое количество клеток содержит различные рекомбинантные плазмиды. Могут также быть клетки, содержащие те самые нежелательные продукты из предыдущего этапа: интактные векторные плазмиды, или фрагменты донорной ДНК. Судьба последних очевидна. Чужеродная ДНК, не имеющая сайта ori, не может реплицироваться в бактериальной клетке и разрушается под действием эндонуклеаз.

Таким образом, задача сводится к тому, чтобы разделить первые три типа бактериальных клеток. Для этого их последовательно высевают на питательные среды, содержащие антибиотики, являющиеся селективными агентами в нашем эксперименте. Нетрансформированные клетки чувствительны к обоим антибиотикам, клетки с интактными плазмидами, напротив, устойчивы к обоим антибиотикам, а клетки с рекомбинантными плазмидами устойчивы только к тому антибиотику, ген устойчивости к которому не поврежден в результате рестрикции и вставки фрагмента донорной ДНК. Поскольку рекомбинантная плазмида содержит все необходимое для инициации репликации, то она может реплицироваться в бактериальных клетках, то есть осуществлять клонирование своей, а также встроенной в нее донорной ДНК.

Помимо бактериальных плазмид для целей клонирования генов используют и другие векторные системы: фаги (в них можно клонировать более длинные, нежели в плазмидах, фрагменты донорной ДНК: до 20 т.п.н), плазмиды-космиды, содержащие cos-участок генома фага, участвующий в упаковке ДНК в фаговую головку (в них можно клонировать фрагменты ДНК до 40 т.п.н), а также так называемые искусственные хромосомы на основе фага Р1 ( можно клонировать фрагменты ДНК длиной 100-300 т.п.н.), на основе F-плазмиды E. сoli (BAC – бактериальная искусственная хромосома, емкость 150-300 т.п.н.), дрожжей (YAC-дрожжевая искусственная хромосома, в ней можно клонировать фрагменты эукариотической ДНК длиной порядка 800 т.п.н и более). В качестве клеток-хозяев для клонирования генов помимо E. сoli используют также Bacillus subtilis, дрожжи Saccharomyces cerevisiae и др.

Выделение генов

С помощью набора разных рестриктаз получают многие тысячи фрагментов ДНК, содержащих самые разнообразные гены. Каким образом в этой смеси найти и выделить фрагмент, который кодирует нужный нам ген, а также регуляторные последовательности, необходимые для его функционирования в клетке? Это один из наиболее сложных и дорогостоящих этапов генетической инженерии. Для решения проблемы идентификации генов разработаны и успешно применяются многие методы, без которых эта задача оставалась бы практически неразрешимой. Так, ученые научились определять последовательность аминокислот в белковых молекулах и последовательность нуклеотидов в нуклеиновых кислотах ДНК и РНК. Разработаны методы получения молекул ДНК (кДНК), комплементарных определенным молекулам мРНК (метод обратной транскрипции). Более того, в настоящее время вполне рутинной процедурой стал химический синтез отдельных генов. Большинство названных методов, а также радиоавтография, хемилюминесцентное маркирование, различные варианты гель-электрофореза, полимеразная цепная реакция и др. в полной мере используются для выделения и идентификации отдельных генов. Рассмотрим, подробнее, каким образом все это используется на практике.

Возможны два основных подхода в выделении гена: либо его синтезируют, либо выбирают среди рестрикционных фрагментов геномной ДНК тот из них, который содержит нужный нам ген. Чаще всего эти подходы используют в различных сочетаниях с учетом конкретной ситуации. Есть гены и протеины – продукты генов, которые изучены очень хорошо, а есть такие, про которые практически ничего не известно. Прокариотические гены выделять в общем проще, чем эукариотические, особенно в тех случаях, когда они расположены на плазмидах: поле поиска намного уже. Большое значение при выделении генов имеет степень и характер их экспрессии: проще выделять те из них, что активно транскрибируются в каких-то определенных тканях, благодаря чему в клетках этих тканей преобладает мРНК искомого гена. В любом случае выделение генов - сложный творческий процесс, требующий от исследователя глубоких знаний и владения широким арсеналом современных методов.