Выделение генов из клонотеки

ДНК-ДНК гибридизацию применяют и для выделения искомых фрагментов ДНК после того, как они были клонированы. Этот подход получил название «дробовик» (shortgun) и его суть состоит в создании и изучении так называемой геномной библиотеки, или клонотеки генов. Эта библиотека представляет собой чашки Петри с большим количеством колоний бактерий, клетки которых содержат рекомбинантные плазмиды со встроенными в них разными рестрикционными фрагментами ДНК. В этом случае электрофорез и Саузерн-блоттинг не требуются, поскольку фрагменты ДНК разделены пространственно по разным колониям бактерий-хозяев. Эти колонии переносят непосредственно на нитроцеллюлозный фильтр, размещая их в определенном порядке. При подготовке проб к анализу проводят лизис бактериальных клеток и денатурацию содержащейся в них ДНК. Затем осуществляют гибридизацию с меченым зондом и определяют, таким образом, в какой колонии клонирован интересующий нас фрагмент ДНК. Этот метод получил название дот-блоттинга (от англ. dot-точка, пятнышко).

Как при выделении генов из клонотек, так и из смеси разделенных с помощью электрофореза рестрикционных фрагментов ДНК, следует иметь в виду, что положительный гибридизационный сигнал может быть получен для нескольких клонов (или полос электрофоретического спектра). Объяснить это несложно: рестриктаза могла внести несколько разрезов по длине гена, или в результате частичного гидролиза образовались фрагменты ДНК, содержащие искомый ген, разной длины. В связи с этим необходимо определить, какой именно клон или фрагмент ДНК содержит ген целиком.

С помощью гель электрофореза и секвенирования каждого выделившегося фрагмента ДНК (вставки) идентифицируют аналогичные фрагменты или фрагменты с перекрывающимися последовательностями. Проводят сшивку отдельных коротких фрагментов и клонирование полученных последовательностей с тем, чтобы составить полный ген. Если вставка анализируемой ДНК в каком-либо из клонов достаточно велика и вполне может содержать весь ген, проводят ее секвенирование, чтобы найти старт- и стоп-кодоны и убедиться в наличии полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей искомый белок. Результаты этого анализа позволяют также наметить план дальнейшей модификации выделенного фрагмента ДНК. Ведь для целей генетической инженерии важно иметь фрагмент ДНК, не содержащий последовательностей, которые не имеют отношения к нужному нам гену.

При создании зондов наибольшую трудность представляет подбор нужного фрагмента ДНК или РНК. Наиболее простой метод состоит в использовании ранее клонированных и идентифицированных генов, можно даже близкородственных видов (гетерологичный зонд). В последнем случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении в последовательности искомой ДНК и зонда.

Зонд можно получить с помощью химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности протеина-продукта искомого гена. Выбирают небольшую часть белковой молекулы длиной 5-6 аминокислот. В соответствии с последовательностью этих аминокислот определяют все возможные последовательности нуклеотидов в том участке мРНК, который кодирует данную область белковой молекулы. Затем из радиоактивно меченых нуклеотидов синтезируют соответствующие олигонуклеотиды длиной не менее 16 звеньев, один из которых будет полностью комплементарен участку искомого гена.

Для зонда можно также использовать препараты мРНК или кДНК, полученные как это было описано выше. Получение большого количества разнообразных кДНК, создание клонотек кДНК, их изучение имеет в генетической инженерии большое значение. По сравнению с клонотеками рестрикционных фрагментов, большинство из которых может и не содержать отдельных генов, или содержать только их части, библиотеки кДНК имеют несомненное преимущество. В случае с кДНК речь, по сути, идет о последовательностях, кодирующих, образно говоря, гены в чистом виде, без интронов и не относящихся к гену последовательностей ДНК.

Главная задача – идентифицировать эти гены. Наиболее надежный способ решения задачи – добиться экспрессии (то есть транскрипции и образования протеина-продукта гена) клонированной кДНК в клетке- хозяине. Для этих целей используют специальные клонирующие векторные плазмиды (экспрессирующие вектора), у которых место встраивания клонируемой ДНК расположено непосредственно за промотором, захватывая лишь несколько нуклеотидов прокариотического гена. Как указывалось выше, бактерии в природе не могут экспрессировать эукариотические гены. Но в случае с данными плазмидами эукариотический ген становится как бы частью прокариотического гена со своим промотором. В результате активности такого гибридного гена в бактерии образуется рекомбинантный эукариотический белок, имеющий лишь несколько аминокислот, кодируемых прокариотическим геном.

Для идентификации эукариотического протеина используют метод, аналогичный дот-блоттингу, в котором в качестве зонда применяют меченые антитела определенных известных белков (метод получил название вестерн-блоттинг).