Метод окраски по Нейссеру

1. Фиксированный мазок окрашивают уксуснокислой синей 4 мин, затем сливают краску.

2. Промывают водой и наливают раствор Люголя на 20-30 сек.

3. Не промывая водой, окрашивают везувином 1-3 мин.

4. Промывают водой, высушивают.

Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.

Нуклеоид

Нуклеоид – ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она циркулярно замкнута, располагается в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны и митотического аппарата.

С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы. ДНК свернуто вокруг центрального стержня, состоящего из РНК и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах 1-3х10⁹, константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК включает 1,6х10⁷ нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате прокариотных и эукариотных клеток обуславливает его название: у первых – нуклеоид (образование подобное ядру), в отличие от ядра у вторых.

В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная информация, которая реализуется в синтезе специфических белковых молекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, репарации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид в прокариотной клетке может быть выявлен в окрашенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа. Для окрашивания ядерного вещества используется краситель Фельгена, который специфически окрашивает ДНК.

Метод окраски ДНК по Фельгену

1. Мазок из культуры бактерий фиксируют 2-3 мин метиловым спиртом и помещают в холодную 1% HCl на 1 мин.

2. Подвергают гидролизу при 60⁰С в 1% HCl 5-10 мин и споласкивают дистиллированной водой.

3. Помещают мазок в реактив Шиффа на 40-60 мин, промывают в водопроводной воде 2 мин.

В результате взаимодействия свободных альдегидных групп с бесцветной фуксинсернистой кислотой появляется фиолетовая окраска, свойственная основному фуксину.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды. Они представляют собой замкнутые в кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500-40 000 пар нуклеотидов и содержащие до 100 генов.

Плазмиды могут существовать в клетке и в интегрированном состоянии с бактериальной хромосомой, сохраняя при этом способность переходить к автономии.

Капсула

Капсула – слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).

В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.

Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.

Метод выявления капсулы по Бурри-Гинса

1. На середину предметного стекла наносят каплю черной туши и смешивают ее с помощью петли с каплей культуры капсульных бактерий.

2. Краем другого предметного стекла делают мазок по типу кровяного. Мазок сушат на воздухе и фиксируют в пламени горелки.

3. Окрашивают 5 мин карболовым фуксином, разведенным водой 1:3.

4. Осторожно промывают водой, высушивают.

Бактерии окрашиваются в красный цвет, неокрашенные капсулы контрастно выделяются на темном фоне препарата.

Жгутики

Жгутики выполняют роль органа движения, позволяющего бактериям передвигаться со скоростью 20-60 мкм/сек. Бактерии могут иметь один (монотрихи) или несколько жгутиков, располагающихся по всей поверхности тела (перитрихи), либо собранные в пучки (лофотрихи).

Перитрихиальное расположение жгутиков характерно для энтеробактерий, возбудителей анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма; монотрихом является холерный вибрион, лофотрихом - псевдомонас. У некоторых видов спирилл различают амфитрихиальное расположение жгутиков. Толщина жгутиков в среднем составляет 10-30 нм, а длина достигает 10-20 мкм.

Основу жгутика составляет длинная спиральная нить (фибрилла), которая у поверхности клеточной стенки переходит в утолщенную изогнутую структуру- крюк и прикрепляется к базальной грануле, вмонтированной в клеточную стенку и ЦПМ (рис. 10).

Базальные гранулы имеют диаметр около 40 нм и состоят из нескольких колец (одна пара у грамположительных бактерий, четыре - у грамотрицательных прокариот). Удаление пептидогликанового слоя клеточной стенки ведет к потере способности бактерий к движению, хотя жгутики при этом остаются неповрежденными.

Рис. 10. Схематическая модель базального конца жгутика Е. coli, основанная на электронных микрофотографиях выделенной органеллы (Стейниер Р. и др., 1979).

Жгутики почти полностью состоят из белка флагеллина с некоторым содержанием углеводов и РНК.

Под микроскопом жгутики можно увидеть лишь после специальных методов протравливания и импрегнации солями серебра и ртути с последующей окраской метиленовой синью (метод Леффлера). При этом необходимо учитывать, что жгутики очень чувствительны к различным механическим воздействиям. О наличии жгутиков можно косвенно судить по направленному характеру движения в «висячей» и «раздавленной» капле в темнопольном и фазово-контрастном микроскопах, либо при светлопольной микроскопии при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.

Окраска жгутиков методом Леффлера

В основе выявления жгутиков лежит осаждение на них красителя, чем достигается увеличение толщины жгутиков и уменьшение их прозрачности.

1. Препарат готовят из 16-18 часовой культуры, которую вносят в 1-2 мл стерильной водопроводной воды до получения тонкой опалесцирующей взвеси.

2. Через 20 мин капля суспензии наносят на поверхность чистого обезжиренного стекла и высушивают на воздухе.

3. Обрабатывают в течение 15 мин протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина, 10 мл 25% водного раствора таннина, 5 мл насыщенного водного раствора сернокислого железа.

4. Препарат промывают водой.

5. Окрашивают карболовым фуксином Циля, разведенным водой в соотношении 1:1, в течение 5 мин при легком подогревании.

6. Промывают водой, высушивают.

При микроскопии готового препарата жгутики видны как тонкие нитевидные структуры.