Сорбенти, що використовуються в молекулярно-ситовій хроматографії

Декстринові гелі застосовуються в основному для фракціонування сферичних біомолекул.

Гелі на основі агарози являють собою лінійні полімери, елементарною ланкою яких є D-галактозо-3,6-ангідридо-L-галактоза. Агароза дає механічно стійкий гель за рахунок водневих зв’язків без поперечних зшивок. Агароза розчиняється в киплячій воді, а при охолодженні утворюється гель. В умовах процесу гель-фільтрації агароза стабільна, але руйнується при дії кислот, лугів, окисників.

Для надання жорсткості та хімічної стійкості, особливо в лужних середовищах, сефарозу іноді «зшивають» 2,3-дібромпропанолом. Така сефароза може діяти в діапазоні рН від 3 до 14 і витримувати нагрівання до 120⁰С.

Для гель-фільтрації використовуються також біогелі серії А на агарозній матриці.

Сефакрил являє собою зернистий гель, який отримують зшиванням алілдекстрину N,N'-метиленбісакриламідом. Сефакрилові гелі характеризуються гідрофільністю, хімічною інертністю, працюють при рН від 2 до 11.

Поліакриламідні гелі отримують кополімеризацією акриламіду та N,N'- метиленбісакриламіду. Пористість та жорсткість гелю визначається відсотковим вмістом у ньому полімеру, а розмір пор – ступенем зшивання компонентів.

У порівнянні з декстриновими та агарозними поліакриламідні гелі відрізняються тим, що можна отримувати більш широкий спектр розмірів пор.

В молекулярно-ситовій хроматографії межі молекулярних мас, в яких відбувається фракціонування речовин, в першу чергу визначаються розмірами пор гелю. Але і розміри зерен полімеру теж мають значення. Із збільшенням розмірів гранул прискорюється потік елюенту і погіршується розділення. Тому для аналітичних цілей слід застосовувати дуже малі гранули сорбенту. Крупніші гранули застосовуються для розділення значних кількостей речовин, коли ступінь розділення не має більшого значення, ніж швидкість розділення.

Для гель-фільтрації, коли треба застосувати високий тиск, використовуються готові фірмові колонки із застосуванням крупнопористих силікагелів у вигляді сферичних гранул діаметром 5 і 10мкм, покритих спеціальними речовинами для пригнічення сорбції на поверхні силікагелю.

Колонки для хроматографування при низькому тиску готуються в лабораторних умовах. Вибір довжини та діаметра колонки визначається об’ємом розчину суміші речовин, що розділяються, і конкретними задачами. Від цього залежить співвідношення висоти і діаметра колонки. Наприклад, якщо метою є знесолення суміші високомолекулярних речовин, відношення висоти до діаметра колонки може становити 10:1, для фракціонування речовин це відношення може становити 100:1. Для фракціонування застосовуються довгі колонки до 3-4 метрів і більше.

Більшість сорбентів, за винятком сефадексів та біогелів типу Р, постачаються у вигляді водних суспензій, які перед внесенням у колонку спочатку фракціонують до вужчого діапазона розмірів, а потім розводять до потрібної консистенції. Колонки треба заповнювати сорбентом якомога однорідніше. Від цього залежить якість розділення речовин. Однорідність заповнення колонки сорбентом перевіряють, пропускаючи крізь колонку розчин забарвленої високомолекулярної речовини.

Замість циліндричної колонки можна застосувати тонкошаровий варіант молекулярно-ситової хроматографії. На скляну пластинку наноситься тонкий шар (0,4-1мм) пористого гелю. При цьому елюювання здійснюється за рахунок руху рідини вздовж пластинки з однаковою швидкістю по всій її ширині. Загальна швидкість елюювання регулюється зміною нахилу пластинки під кутом від 5 до 20⁰. На кінці пластинки рівномірно розташовуються гноти з фільтрувального паперу, які занурюються з другого краю в резервуари з елюентом. Суміш речовин, що розділяються, наноситься на стартову лінію у верхній частині пластинки.

Гель-фільтрація в тонкому шарі має високу чутливість та швидкість розділення, для цього достатньо використання малих кількостей речовин, що аналізуються, можливе одночасне дослідження багатьох препаратів. Іноді тонкошарова гель-фільтрація може доповнити або навіть замінити електрофорез та електрофокусування.

Цей метод застосовується для розділення, визначення молекулярних мас та перевірки чистоти високомолекулярних гідрофільних сполук.