В диагностике инфекционных болезней

Генетические методы применяются в практических целях как для обнаружения микроба в исследуемом материале без выделения чистой культуры, так и для определения таксономического положения микроба и проведения внутривидовой идентификации.

Методы, используемые для внутривидовой идентификации бактерий

Рестрикционный анализ основан на применении ферментов, носящих название рестриктаз. Рестриктазы представляют собой эндонуклеазы, которые расщепляют молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Размер каждого типа фрагментов можно узнать с помощью электрофореза в агарозном геле: мелкие фрагменты перемещаются в геле быстрее, чем более крупные фрагменты, и длина их пробега больше. Гель окрашивают и фотографируют в УФ-излучении. Таким способом можно получить рестрикционную карту определенного вида микробов.

Сопоставляя карты рестрикции ДНК, выделенных из различных штаммов, можно определить их генетическое родство, выявить принадлежность к определенному виду или роду, а также обнаружить участки, подвергнутые мутациям. Этот метод используется также как начальный этап метода определения последовательности нуклеотидных пар (секвенирования) и метода молекулярной гибридизации.

Определение плазмидного профиля бактерий.Плазмидный профиль позволяет произвести внутривидовую идентификацию бактерий. Для этого из бактериальной клетки выделяют плазмидную ДНК, которую разделяют электрофорезом в агарозном геле для определения количества и размеров плазмид.

Методы, используемые для обнаружения микроба без

выделения его в чистую культуру

Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК. Применяется при идентификации микробов для определения их точного таксономического положения, а также для обнаружения микроба в исследуемом материале без его выделения в чистую культуру. Метод основан на способности двухцепочечной ДНК при повышенной температуре (90 °С) в щелочной среде денатурировать, т.е. расплетаться на две нити, а при понижении температуры на 10 °С вновь восстанавливать исходную двухцепочечную структуру.

Для проведения молекулярной гибридизации исследуемую ДНК расплетают указанным выше способом, одну нить фиксируют на специальном фильтре, который затем помещают в раствор, содержащий зонд(участок искусственно созданной ДНК с определенной последовательностью оснований). Создаются условия, благоприятные для образования двойных спиралей. При наличии комплементарности между зондом и исследуемой ДНК они образуют между собой двойную спираль, наличие которой фиксируют различными методами.

Бактериофаги.

Вирусы – это формы жизни, которые относят к отдельному царству Vira. Наука о вирусах – вирусология – одна из самых молодых медицинских наук.

В настоящее время вирусы определяют как самостоятельные самопродуцирующиеся неклеточные структуры, способные функционировать в восприимчивых к ним клетках животных, растений, бактерий.

Вирусы, способные паразитировать в бактериальных клетках, репродуцироваться в них и вызывать их растворение, получили название бактериофаги, или просто ФАГИ. В настоящее время эти вирусы выявлены не только у большинства болезнетворных бактерий, но и у некоторых грибов.

Большинство бактериофагов под электронным микроскопом имеют форму головастика или сперматозоида, но могут быть нитевидной или кубической формы, размером от 20 до 800 нм.

Наиболее хорошо изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида. Они состоят из икосаэдрической головки размером 65-100нм и хвостового отростка длиной 100 нм. В головке содержится нуклеиновая кислота – ДНК, реже РНК. Она окружена белковым капсидом. Кроме структурных белков, у некоторых фагов обнаружены внутренние (геномные) белки, связанные с нуклеиновой кислотой и белки-ферменты (лизоцим, АТФ-аза, участвующие во взаимодействии фага с клеткой).

Внутри хвостового отростка имеется полый цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой, снаружи – чехол, который способен сокращаться. Хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластиной с короткими шипами, от которых отходят нитевидные структуры – фибриллы. У некоторых видов фагов чехол не может сокращаться. Фаги встречаются везде, где есть или были бактерии. Например, дизентерийные, брюшнотифозные фаги обнаруживаются в стоячей воде, почве, испражнениях человека.

Фаги обладают строгой специфичностью и поражают лишь определённые виды или типы бактерий.

Различают поливалентные фаги, способные вызывать лизис группы родственных видов м/о, моновалентные фаги, лизирующие культуры бактерий определённого вида, типовые фаги, лизирующие отдельные типы внутри вида,

По способу взаимодействия с клеткой-хозяином фаги делятся на:

1. Вирулентные – проникающие в микробную клетку, размножаются в ней и вызывают её лизис.

2. Умеренные – вступают в своеобразные симбиотические отношения с микробной клеткой: проникнув в клетку, они встраивают свой геном в геном бактерии и реплицируются вместе с ней. Таким образом, каждое новое поколение бактериальной клетки содержит в своем геноме геном фага. Это явление получило название – лизогения. Умеренные фаги могут быть дефектными, т.е. неспособными образовывать фаговое потомство, такие фаги используют в качестве векторов-переносчиков генетической информации в генной инженерии.