Теоретические основы замораживания спермы

Хранение спермы вне организма, цель которого – увеличить срок выживаемости спермиев и сохранить оплодотворяющую способность спермы при хранении в замороженном или незамороженном состоянии, основано на снижении интенсивности обменных процессов в сперме, иными словами, на создании условий, при которых спермин впадают в анабиоз.

Разработаны различные методы хранения спермы: кратковременное хранение (спермы быков, баранов, хряков и жеребцов) при температурах выше 0°С и длительное хранение в жидком азоте (спермы быков и жеребцов).

Хранение спермы быка и барана при 2…5°С. Свежеполученную сперму быков и баранов после оценки ее качества разбавляют средой, снова проверяют под микроскопом активность спермиев и фасуют.

Слишком быстрое охлаждение спермы приводит к гибели спермиев от температурного шока. Поэтому фасованную сперму охлаждают до температуры 2…5°С постепенно – в течение 2…3 ч. Для этой цели разбавленную сперму быка вначале помещают в стеклянный стакан с теплой водой (30°С), а затем переносят на водяную баню (22°С) на 20 мин, после чего фасуют при комнатной температуре.

Сперму барана (фасованную) выдерживают при комнатной температуре 10…15 мин. Ампулы, пробирки или флаконы обертывают слоем ваты или упаковывают в поролоновые амортизаторы, помещают в полиэтиленовые или резиновые мешочки, которые герметически закрывают, и постепенно охлаждают до 2…5°С в бытовом электрохолодильнике или в пищевом термосе со льдом. Упаковку со спермой кладут на лед или обкладывают ее льдом со всех сторон.

Разбавленную сперму быка, сохраняемую при 2…5°С, используют для искусственного осеменения коров и телок в течение 3 сут при активности спермиев не ниже 7 баллов; сперму барана используют в течение 1 сут, иногда 36 ч при активности спермиев не ниже 8 баллов.

Хранение спермы быка при температуре 2…20°С. Были предложены синтетические среды, благодаря которым можно сохранять сперму при сравнительно высоких температурах, например разбавитель ТВТ-12 (температура хранения от 15 до 18°С), а также сульфатная среда НСС (температура хранения от 2 до 20°С).

Хранение спермы жеребца при 2…5°С. Разбавленную сперму жеребца после повторной проверки на активность спермиев фасуют в стерильные стеклянные баночки объемом 50…100 мл и закрывают притертыми пробками, которые закрепляют резиновым кольцом. Баночку со спермой помещают в трехслойный марлевый или полиэтиленовый мешочек и переносят в термос со льдом. Для хранения и перевозки спермы используют термос конструкции Всесоюзного научно-исследовательского института коневодства. Сперму жеребца, сохраненную при температуре 2…5°С, можно использовать для осеменения кобыл в течение 48 ч.

Хранение спермы хряка при 16…20°С. Полученную сперму разбавляют средами ГХЦС или ГХЦ, оценивают активность спермиев. Сперму разливают в стеклянные колбы или полиэтиленовые флаконы, которые негерметично прикрывают целлофаном или пергаментной бумагой и хранят в темном месте при температуре 16…20°С. При более низкой температуре (но не ниже 6°С) сперму разбавляют ГХЦСЖ или ГХЦЖ. Сперму, сохраняемую при плюсовых температурах, используют для осеменения свиноматок в течение 3 сут при активности спермиев не ниже 6 баллов.

Хранение спермы быка, барана, хряка, жеребца в жидком азоте. Благодаря замораживанию можно хранить сперму несколько лет и даже десятилетий, перевозить на любые расстояния и всегда иметь на станциях сперму лучших производителей.

При температурах выше 0°С обменные процессы в сперме хотя и замедляются, но не прекращаются. Продолжается накопление вредных продуктов распада и начинается процесс разрушения передней части головки спермия – акросомы, которая выполняет важную функцию при оплодотворении яйцеклеток.

Удлинить сроки хранения спермы можно путем еще большего замедления обменных процессов, для чего необходимо охладить ее до отрицательных температур. Но уже при -0,6°С сперма начинает замерзать, а спермии погибают. Основная причина гибели – кристаллическое замерзание воды. Теоретической основой метода быстрого замораживания спермы послужила гипотеза о возможности стеклообразного некристаллического замерзания (витрификация) биологических объектов (в том числе и спермы).

Если сперму охлаждать медленно, то вся вода, содержащаяся в ней, успеет превратиться в ледяные кристаллы и спермии погибнут. При очень быстром охлаждении удается «проскочить» опасную температурную зону кристаллизации и достичь зоны витрификации, где протоплазма спермиев затвердевает как единое целое, без вымерзания воды и образования кристаллов льда; при этом сохраняется тонкая структура протоплазмы и ядра. Глубокое охлаждение спермы до температуры жидкого азота достигается в течение нескольких минут.

Замораживание спермы быка. Для замораживания в жидком азоте пригодна сперма с концентрацией спермиев не менее 0,8 млрд/мл и активностью не ниже 8 баллов. На фторопластовых пластинах в форме гранул сперму замораживают так. После получения и оценки сперму разбавляют лактозо-желточной средой с глицерином. Среду подогревают до 30…35°С. Сперму разбавляют в 2… 10 раз и более в зависимости от объема гранул. Если объем гранул 0,1…0,2 мл, то необходимы меньшие степени разбавления, и тогда на пункте искусственного осеменения сперму перед использованием надо разбавить: для этого гранулы размораживают во флаконе с 1 мл 2,9%-го раствора цитрата натрия, подогретого до 38…40°С. Сперму, предназначенную для размораживания в гранулах объемом 0,5 мл, разбавляют в 10 раз и более и перед осеменением больше не разбавляют. Для осеменения коров две гранулы помещают в стерильный флакон и погружают его в теплую воду (38…40°С).

Разбавленную сперму охлаждают до 2…5°С в течение 3…4 ч, а затем разливают градуированными пипетками, полиэтиленовым шприцем или разливочной машиной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. Пластину выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5…10 см в течение 1,5…2 мин, а затем погружают ее в жидкий азот на 1…2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранулы собирают в сачок или контейнер и пересыпают в охлажденный контейнер, который помешают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением из чашек пинцетом достают охлажденные до -196°С гранулы, размораживают их, оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности спермиев не ниже 4 баллов.

В облицованных гранулах (но Остатка) (рис. 1) замораживают свежеполученную сперму, разбавленную средами №1 и 2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые флаконы по 200…400 мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления. Сперму сначала разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре 5…10 мин, затем средой №2 до требуемой концентрации (15 млн в дозе).

Сперму разбавляют с помощью специального устройства, благодаря которому можно дозировано вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой.