Характеристика этапов

Хотя для получения продуктов микробиологического синтеза применяются различные культуры микроорганизмов и исполь­зуются разные питательные среды и режимы культивирования, тем не менее процессы синтеза имеют общую структуру. Это вид­но из приведенной ниже схемы:

Приготовление и сте­рилизация питательной среды. Для выращива­ния микроорганизмов в цехе чистой культуры и в цехе основной фер­ментации необходима стерильная питатель­ная среда. Это делают в сырьевом или рецеп­турном цехе. Среду го­товят по периодическо­му или непрерывному методу. В отдельных случаях приготовление и стерилизация среды осуществляются прямо в ферментаторе. На со­временных микробио­логических предприя­тиях все чаще исполь­зуют непрерывный метод приготовления среды (рис. 4.15). Для этого используют два резервуара: в один вводят исходные вещества, а из другого жид­кость идет в смеситель непрерывного действия. Из него среда при помощи насоса подается в колонну стерилизации и на выдержи­вание, а затем — в охладитель.

Рисунок 4.15 – Схема непрерывного приготовления питательной среды:

1 и 2 – резервуары для растворения исходных веществ, 3 – резервуар для смешивания растворов, 4 – насос для передачи среды, 5 – колонна или инжектор для нагрева среды паром, 6 – закрытый сосуд для стерилизации, 7 – охладитель, 8 – резервуар для спуска нагретой воды, 9 – ферментор

Выбор аппаратуры и технологии приготовления питательной среды зависит от количества и вида компонентов. Компоненты растворяют в подогретой или горячей воде. Если с точки зрения совместимости и стерилизации это возможно, то все они могут быть растворены в одном реакторе. В противном случае компо­ненты растворяют по группам и затем соединяют в смесителе. Ес­ли среду стерилизуют периодически паром или при помощи теп­лообменника, надо довести весь объем питательной среды до 120°С и после этого по меньшей мере час выдержать при 120— 124°С. Затем среду охлаждают до 29—30°С.

При непрерывной стерилизации нагревание среды до темпе­ратуры стерилизации, выдерживание при этой температуре и ох­лаждение происходят в потоке. Прямая подача пара в среду раз­бавляет ее на 10—20%, это надо учитывать при приготовлении среды. При работе с колонками используют пар давлением 0,5 МПа (5 кгс/см2). Скорость потока среды в колонке зависит от состава и температуры.

В кожух выдерживателя вводят пар давлением 0,25 МПа (2,5 кгс/см2). Длительность выдерживания (5—7 мин) зависит от состава и свойств питательной среды. Температура среды, выте­кающей из выдерживателя, 124—130°С.

Приготавливая среду, надо следить, чтобы в процессе стери­лизации не происходили нежелательные реакций (карамелизация, образование меланоидинов). Если в цехах чистой культуры и ос­новной ферментации работают с разными средами, то необходимо иметь две и более линий для приготовления питательных сред. В цехе приготовления среды необходимо иметь различную изме­рительную аппаратуру (весы, мерную посуду, дозаторы), аппара­туру для растворения вискозных и твердых веществ, снабженную мешалками (обычные реакторы), центрифуги для осветления рас­творов (кларификаторы), устройства для декантации и др.

Хранение культуры и размножение посевного материала в ла­боратории. Культуры микроорганизмов — продуцентов веществ— заводы получают из институтов (коллекции культур) в пробир­ках на косом агаре или в ампулах, законсервированными в виде чистых культур. Каждая культура имеет паспорт с подробным описанием морфологии, физиологии, характеристики среды для культивирования и хранения культуры.

При длительном хранении культуры важно сохранить ее свой­ства. При частом пересеве она со временем может изменять свой­ства — уменьшается продуктивность, появляется гетерогенность культуры, — т. е. различные варианты культуры с отличающей­ся морфологией и физиологией.

В гомогенности или гетерогенности культуры можно убедить­ся, высевая ее на твердую питательную среду и изучая морфоло­гические и физиологические свойства колоний.

Чтобы сохранить свойства культуры без изменений, ее надо хранить в соответствующих условиях. В основе хранения культур лежит охлаждение, замораживание или обезвоживание.

Во всех этих случаях ограничивается или даже прекращается клеточный обмен веществ. Иногда (при замораживании и обезво­живании) клетки приводят в состояние анабиоза или преданабиоза.

На практике культуры хранят различными способами;

– на косом агаре при низкой температуре (1 - 5°С) можно хранить культуру 1—2 мес, а иногда и дольше;

– замораживание и хранение при температуре ниже —20°С позволяет сохранить культуру в течение нескольких месяцев. Не желательно многократное оттаивание и замораживание;

– на твердых средах под слоем стерильного парафина или минерального масла можно хранить дрожжи, плесневые грибы. Менее пригоден этот способ для хранения актиномицетов. Слой масла над поверхностью косого агара должен быть не менее 1 см. Масло предохраняет культуру от высыхания и доступа кислоро­да;

– на агаре без добавления питательных веществ (допускают­ся очень незначительные добавки питательных веществ) хранят актиномицеты;

– при лиофилизации культуру замораживают при температу­ре до —80°С (обычно при —30°С) и подвергают сублимации в ва­кууме (остаточное давление 6—130 кПа). Для предохранения клеток от инактивации используют защитные среды (сыворотка крови, бульон, сахароза, смесь песка и глины и др.). Лиофилизированную чистую культуру в ампулах хранят в течение несколь­ких лет;

– хранение в стерильной смеси песка и глины заключается в следующем. Нанесенные на эту смесь микроорганизмы или сус­пензию спор сушат при комнатной температуре и при такой же температуре хранят в посуде, закрытой ватной пробкой;

– консервация спор (актиномицеты) в песке. Около 1,0 г сте­рильного песка насыпают в пробирку, высевают туда же споры и сушат их в эксикаторе над силикагелем или хлористым кальцием. После сушки пробирки герметично закрывают пробками и зали­вают парафином.

Через определенное время, специфичное для каждого вида хранения, культуру пересевают.

Перед началом технологического процесса культуру размно­жают в лаборатории в стерильных условиях при оптимальном составе среды и режиме выращивания (рН, температура, дли­тельность). С поверхности косого агара культуру стерильно пере­носят в колбы объемом 100—200 мл и инкубируют в термостате или на качалке в зависимости от потребности культуры в кислороде. В производстве дрожжей для этого используют, например, колбы Пастера (0,45 л), затем колбы Карлсберга (4,5 л). Дли­тельность каждой стадии выращивания 24 ч. На этом этапе дрож­жи растут на полноценной среде — 10%-ном солодовом сусле. Содержимое колб Карлсберга используют в качестве посевного материала для первого инокулятора цеха чистой культуры. Однако последовательность стадий не всегда одинакова. В производ­стве аминокислот, например лизина, в цех чистой культуры по­ступает посевной материал, полученный из колб на качалке.

Иногда для уменьшения опасности заражения инфекцией в инокулятор культуру вносят прямо из пробирок. При этом дли­тельность инокуляции увеличивается.

В производстве антибиотиков часто используют споровый ма­териал. При этом в лабораторных условиях культуру размножа­ют двумя способами:

– культуру продуцента высевают на косой агар, инкубируют до образования спор и смывают их стерильной водой. Суспензию спор снова переносят в свежую агаризированную среду для полу­чения спорового материала второго поколения. Выросшие споры еще раз смывают стерильной водой и суспензию используют для получения первого вегетативного поколения продуцента на жид­кой среде;

– как и в первом случае, культуру продуцента высевают на агаризованную среду для получения спор. Полученную суспен­зию спор сразу же вносят в колбы с жидкой средой и выращива­ют их на качалке. Полученный таким образом вегетативный ма­териал продуцента первого поколения используют в качестве по­севного материала для второго поколения продуцента в колбах с жидкой средой. Вегетативный материал второго поколения ис­пользуют для внесения в инокулятор. Для размножения спорово­го материала широко используют среды на сыпучем материале— зерне, крупе, лузге и др.

Для получения спор многих продуцентов антибиотиков часто используют среду из зерен проса. Споровый материал с таких сред можно засевать прямо в инокулятор, минуя размножение на жидкой среде в колбах. Иногда в лабораторной практике культу­ру продуцента начинают размножать сразу на жидкой среде в колбах, исключая предварительное получение спор.

Для обеспечения стабильного выхода активных веществ в производственных условиях надо создать достаточный запас куль­туры продуцента на длительный период времени (год и более), но нельзя часто менять технологию приготовления посевного ма­териала.

Получение посевного материала в цехе чистой культуры.Дальнейшее размножение посевного материала обычно идет в две стадии: в цехе чистой культуры и в отделе инокуляции. Аппа­раты первой стадии часто называют инокуляторами, аппараты второй стадии — посевными ферментаторами.

Схема приготовления посевного материала из споровых культур на предприятиях по производству антибиотиков показа­на на рисунке 4.16.

Рисунок 4.16 – Схема приготовления посевного материала:

1 – законсервированный штамм продуцента, 2 – первое поколение на косом агаре в пробирке с образованием спор, 3 – второе поколение на твердой среде в колбах с образованием спор, 3а и 3б – первое и второе поколение на жидкой среде в колбах, 4 – инокулятор, 5 – посевной ферментатор, 6 – ферментатор

Для приготовления посевного материала используют полно­ценную среду, тщательно проверенную различными химическими и микробиологическими методами. Количество питательной сре­ды в аппарате не должно превышать 60% общего объема. Если культуру в инокулятор вносят из колб, то количество посевного материала составляет примерно 0,1% объема среды. Такое не­большое количество посевного материала требует длительного периода инокуляции (2—4 сут). Для посевных ферментаторов ис­пользуют 10—12% инокулята, поэтому продолжительность при­готовления посевного материала на этой стадии уменьшается и обычно не превышает 1 сут. Во время приготовления посевного материала надо следить, чтобы в аппаратах был оптимальный режим культивирования. Три раза в сутки отбирают образцы для микробиологического и биохимического анализов. Посевной ма­териал для главной ферментации готовят в количестве 5—20% объема используемой питательной среды.

Главная ферментация. Обычно она протекает в ферментато­рах большого объема. Для стерильной ферментации ши­роко используют аппараты объемом 50м³ с механическими мешал­ками. Перед заполнением аппарата средой его моют, проверяют на герметичность, стерилизуют горячим паром как сам ферментатор, так и систему трубопроводов. Для обеспечения стериль­ности ферментатора часто применяют предварительную обработку его химическими дезинфицирующими веществами (этот процесс проводят непосредственно перед обработкой горячим па­ром). После этого его заполняют стерильной охлажденной пита­тельной средой. Количество среды в ферментаторе не должно превышать 70% его общего объема. Затем по линии посевного материала с помощью стерильного воздуха в ферментатор вво­дят посевной материал. Уже перед его подачей температура и рН питательной среды должны быть доведены до оптимальных зна­чений для данной культуры. Соответственно регулируют интен­сивность аэрации и перемешивания среды. Для предотвращения попадания нестерильного атмосферного воздуха в аппарат давле­ние воздуха над поверхностью жидкости повышают на 20— 30 кПа (0,2—0,3 кгс/см2). В пространстве над жидкостью обыч­но скапливается пена. Если ее слой сильно увеличивается, то в аппарат вводятся химические пеногасители. Во время фермента­ции автоматически регулируется температура и рН среды, в слу­чае необходимости добавляют растворы кислоты или щелочи. По специальному графику берут образцы жидкости из ферментатора для биохимического и микробиологического контроля. При полу­чении активных веществ методом периодической ферментации различают два этапа.

На первом этапе идет интенсивное размножение культуры. Она проходит через все характерные фазы развития. На этом эта­пе компоненты питательной среды используются главным обра­зом на получение энергии и конструктивный обмен веществ — происходит постепенная ассимиляция источников углерода и азотсодержащих веществ, в среде накапливаются продукты окис­ления углеводов, например кислоты.

На втором этапе происходит интенсивный синтез нужного ме­таболита (иногда он идет параллельно процессу роста культуры), наблюдается старение клеток и их автолиз.

Ферментацию прекращают, когда в среде накапливается мак­симальное количество полезного продукта. Конец ферментации можно определить и микробиологически по морфологическим из­менениям клеток продуцента. Окончив ферментацию, культуральную жидкость охлаждают до 10—15°С и перекачивают в резер­вуары, из которых она постепенно подается на дальнейшую обработку.

Выделение продукта из культуральной жидкости. В состав культуральной жидкости входят остатки использованной пита­тельной среды, синтезированные метаболиты и клеточная масса продуцента. В наиболее простом случае всю культуральную жид­кость можно использовать как готовый продукт, например при получении бактериальных удобрений, если их применяют в жид­ком виде. В спиртовой промышленности амилолитические ферменты плесневых грибов иногда используют в жидком виде. При производстве витаминных и аминокислотных концентратов для нужд животноводства иногда используются все продукты фер­ментации. В таких случаях культуральную жидкость упаривают в вакуум-аппаратах и сушат в сушилках распылительного типа.

В производстве дрожжей, бактериальных удобрений и средств для защиты растений полезным продуктом является клеточная масса микроорганизмов.

Для выделения биомассы используют сепараторы, осадительные центрифуги, фнльтр-прессы, вакуум-фильтры или отстойни­ки. Иногда биомассу осаждают добавлением электролитов (FеС1₃), надосадочную жидкость декантируют. После центрифу­гирования биомассу получают в виде густой жидкости или пасты 75—90%-ной влажности. Клеточную массу промывают, фильтру­ют, сушат, гидролизуют, экстрагируют из нее нужный продукт и т. д. Если активное вещество находится в растворе, то биомассу используют после отделения как побочный продукт, а нужное ве­щество выделяют из раствора различными химическими или фи­зическими методами:

– отгонка спиртов и органических растворителей;

– осаждение кислот в виде солей;

– выделение аминокислот с помощью ионитов, с последую­щей элюцией, упариванием элюата и кристаллизацией;

– антибиотики выделяют, осаждая в виде малорастворимых солей из водного раствора, где они предварительно максимально концентрируются путем экстракции или ионообменным путем, а также высушивая водные растворы лиофилизацией или в сушил­ках распылительного типа.

Допустимо производство нескольких препаратов микробного происхождения на одном предприятии и даже в одном цехе толь­ко в том случае, если они не являются антагонистами. Надо из­бегать соседства с производством культур, образующих споры, если продуцент основного вещества является бесспоровым мик­роорганизмом. При организации производства надо изолировать отдел обработки сухой активной биомассы во избежание ее рас­пространения в виде пыли. На предприятиях микробиологическо­го синтеза можно обеспечить высокие экономические показатели и выпуск продукции высокого качества только прн наличии от­личных санитарных условий и высокой культуры производства. Регулярная чистка аппаратуры и коммуникаций, стерилизация, светлые тона окраски стен и аппаратуры, гладкие поверхности, кондиционированный воздух, безукоризненно чистая спецодежда рабочих — таким должно быть современное предприятие микро­биологического синтеза.