Основные стадии и показатели роста микроорганизмов

Организация любого микробиологического процесса синтеза практически важных веществ начинается с изучения физиологии продуцента.

Необходимо изучить характер питания продуцента, а также влияние внешних факторов на состояние клеток и популяций. Вопросы эти выясняются путем оптимизации исследуемого про­цесса. Основой для этого является культивирование микроорга­низмов в контролируемых и управляемых условиях.

Оптимизация давно существующих промышленных процессов начиналась с эмпирического подбора условий методом «проб и ошибок». При большой затрате времени и труда в конечном итоге устанавливали состав сред и режим культивирования, на­иболее приемлемые экономически и, которые в дальнейшем также эмпирически возможно совершенствовать при ведении процесса в промышленном масштабе.

Долгое время не существовало иного способа культивирования микроорганизмов в лаборатории, кроме периодического: засев — размножение продуцента —- съем выросшей культуры и выделе­ние нужного продукта из клеток или из среды.

В промышленности с давних пор существовали и другие спо­собы культивирования микроорганизмов: непрерывно-проточный метод получения этилового спирта из мелассы и проточный метод получения уксуса из спирта при помощи бактерии, иммобили­зованных на твердой фазе — древесных стружках. Эти методы пришли в лабораторную практику на десятилетия позже, когда появились новые технические возможности и новые взгляды на проблемы культивирования микроорганизмов.

По мере развития технологии производства, изучения физио­логии и биохимии микроорганизмов методы их культивирования в лаборатории и в промышленности совершенствовались и видо­изменялись. Многие технологические приемы проведения химиче­ских реакций оказались пригодными для микробиологических процессов, прежде всего проведения их в реакторах — фермен­терах со всем необходимым для этого оснащением. Существует ряд методов культивирования микроорганизмов, применяемых на лабораторном этапе разработки промышленного процесса, а затем ведутся в укрупненном масштабе в емкостях среднего размера (десятки литров) и, наконец,— в крупномасштабном варианте, в емкостях в сотни кубометров. Все методы культивиро­вания микроорганизмов делятся на периодические и непрерыв­ные.

Периодическое культивирование - начало изучения микробиологического синтеза. Изучение процесса микробного биосинтеза обычно начинается с исследования динамики роста периодической культуры. Цикл развития периодической культуры (не имеющей аналогии с цик­лом развития многоклеточного организма) начинается с засева среды. Засев осуществляется в таком количестве, которое обес­печивает начало роста микроорганизмов с минимальной задерж­кой или даже без лаг-фазы. Лаг-фаза мало дает для понимания хода биосинтеза, ее наличие свидетельствует только о недоста­точно хорошем качестве и количестве посевного материала или о неоптимальности условий для роста. Для многих микробиоло­гических процессов активный «омоложенный» посевной материал применяют в количестве около 2% от объема среды.

Прослеживают ход накопления биомассы и интересующего продукта, а также потребление исходного основного сырья, обычно углеродного. Для этого отбирают пробы развивающейся культуры с частотой, позволяющей уловить фазы экспоненциаль­ного роста, и заканчивают наблюдения после остановки роста (рис. 4.1) и накопления максимума целевого продукта. Получен­ные кривые роста и накопления продукта показывают, является ли его образование связанным с ростом биомассы, т. е. первичным, или это процесс второй фазы, когда рост заторможен, по вырос­шая биомасса может перерабатывать оставшийся недоисполь­зованным субстрат. Бывают, однако, случаи, когда интересую­щий продукт второй фазы начинает синтезироваться еще в фазу роста, так что подразделение процессов на одно- и двухфазные не носит абсолютного характера.

Рисунок 4.1 – Кривая роста микроорганизмов в полулогарифмическом масштабе: х – концентрация биомассы, I – лаг-фаза, II – фаза ускорения роста, III – экспотенциальная фаза, IV – фаза замедления роста, V – стационарная фаза, VI – фаза отмирания

Наличие вторичных продуктов (метаболитов) в отличие от первич­ных в большинстве своем для жизни продуцента необязательно. Они об­разуются в том случае, когда состав среды таков, что для дальнейшего роста биомассы каких-либо компо­нентов начинает недоставать, но жи­вые клетки способны синтезировать некоторые вещества и в среде имеют­ся материалы для этого. Иногда вто­ричный биосинтез связан с видоиз­менением нормального роста клеток из-за лимитирования или ингибировапия. Среди вторичных продуктов встречаются искаженные вещества клеточной оболочки, предшественни­ки веществ, входящих в состав спор, производные аминокислот, пептидов, углеводов, нуклеотидов, а иногда их сложные комплексы. Типичными продуктами конструктивного метаболизма второй фазы роста культур являются антибиотики. Вторичными могут быть и продукты энергетического метаболиз­ма. Например, у некоторых бродильных микроорганизмов продук­тами первичного метаболизма углеводов часто являются органи­ческие кислоты, но при ингибировапии роста создающимися экстремально кислыми условиями среды вместо них образуются нейтральные вещества - спирты, кетоны, которые часто и являют­ся целевыми продуктами.

Во вторую фазу могут осуществляться и сверхсинтезы про­дуктов первой фазы роста культур, часто бесполезные в это вре­мя для самого продуцента. Состав среды может быть таким, что вещества, необходимые для нормального роста микроорга­низмов, исчерпываются, но имеются субстраты и активные ферменты, участвующие в синтезе тех или иных продуктов нормаль­ного метаболизма первой фазы. Такими являются, например, витамины.

Способность к сверхсинтезам продуктов второй фазы особен­но сильно выражена у специально полученных мутантов; послед­ние имеют изменения в генетическом аппарате, препятствующие нормальному метаболизму. В результате реакции отклоняются в сторону обильного накопления веществ, необходимых клетке лишь в небольшом количестве. Среди них встречаются практи­чески ценные продукты. Кроме генетического контроля вторично­го синтеза и сверхсинтеза огромное значение имеет физиологи­ческий контроль, или управление метаболизмом популяций.

Биохимические механизмы изменения метаболизма обусловлены репрессией и депрессией синтеза определенных ферментов или изменением их активности. Эти изменения часто в наиболь­шей степени выражены в среде, не оптимальной для роста, но оптимальной для биосинтеза определенного продукта. Для этого некоторые компоненты среды должны быть в недостатке, чтобы основное исходное сырье перерабатывалось биомассой в целевой продукт.

До недавнего времени лимитирующие рост факторы выявля­лись только путем эмпирического поиска и обнаруживались слу­чайно. Так установлено, что многие антибиотики, образуемые актиномицетами, синтезируются при лимитации роста проду­центов недостатком фосфата, для биосинтеза пенициллина требуется лимитация роста культур глюкозой, а для грамициди­на С — молекулярным кислородом. Целенаправленные поиски факторов, необходимых для каждого процесса, лимитирующего или ингибирующего рост продуцентов, значительно сокращают подбор оптимальных условий для их биосинтеза. После получе­ния заданного количества биомассы в условиях, оптимальных для роста культур, добавки элементов питания (кроме лимити­рующего), обеспечивающие синтез продукта, могут продлить его образование.

Большинство промышленных микробиологических процессов ведут на сложных средах, часто используя отходы других произ­водств или сельского хозяйства из-за их дешевизны. Естественно, что и в лабораторных условиях процесс отрабатывается на тех же средах. На сложных средах можно определить фазу наиболее активного биосинтеза целевого продукта, его скорость, продук­тивность процесса, выявить оптимальную температуру, рН, сте­пень аэрации. Для оптимизации роста микроорганизмов и полу­чения продуктов первой фазы этого достаточно. Но на сложных средах невозможно выявить лимитирующие рост культур компо­ненты питания: источники углерода, азота, фосфора, витамины и др., недостаток которых приводит к синтезу вторичных мета­болитов. Этот вопрос можно решить только на синтетических или полусинтетических средах. Если микроорганизмам необходимы витамины или аминокислоты, то их вносят в среду в небольших количествах, например, в виде автолизата или экстракта дрож­жей, содержащих почти все необходимые витамины и амино­кислоты. Если продуцент растет при небольших добавках дрож­жевого автолизата, например, в пределах 0,2 г/л и рост возмо­жен за счет потребления минеральных соединений азота (аммо­ния или нитрата), то автолизат можно рассматривать как источ­ник витаминов. Если же автолизат дрожжей требуется в боль­ших количествах, а минеральные соединения азота не исполь­зуются, то организм, следовательно, нуждается в готовых амино­кислотах и (или) других органических веществах.

Применяя набор синтетических сред с заранее предусмотрен­ным ограничением роста культур микроорганизмов известным компонентом, выявляют нужный для данного биосинтеза лимитирующий или ингибирующий фактор и нужные концентрации других компонентов, чтобы они не были в недостатке.

Если потребности микроорганизма неизвестны, то оптимиза­ция условий питания и понимание физиологии продуцента за­труднено. Полезно применение методов математического плани­рования экспериментов. Они ускоряют поиск оптимальных усло­вий, но не заменяют собой изучение физиологии питания про­дуцента для понимания его потребностей в условиях роста и биосинтеза целевых продуктов.

Непрерывное культивирование микроорганизмов. Метод проточного непрерывного культивирования пришел в микробиологию из химической технологии. Принцип проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная сре­да и одновременно вытекает такой же объем культуры. По тако­му принципу организуются две разновидности процессов не­прерывного культивирования: процесс полного вытеснения и про­цесс полного смешения.

Непрерывные процессы имеют значительные преимущества перед периодическими: возможность специализации аппарату­ры для каждой операции (стадии) непрерывного процесса, стабилизации его во времени, улучшение качества продукта, легкость регулировки и, главное, возможность автоматизации. Этими преимуществами объясняется тенденция микробиологов к переходу от периодических процессов к непрерывным.

Процесс полного вытеснения. Сосуд для выращивания микроорганизмов (трубчатый фер­ментер) представляет собой трубку, расположенную горизонталь­но или вертикально, в которую втекают среда и посевной материал и вытекает культура (рис. 4.2). Перемешивания не производится. Так можно культивировать микроорганизмы, не требующие аэрации. С одного конца ферментера подаются среда и посевной материал, популяция находится в начале своего раз­вития. По ходу трубки культура «стареет», субстрат исчерпы­вается, накапливаются продукты ме­таболизма и вытекающая культура находится в состоянии, аналогичном стационарной фазе роста периодиче­ской культуры. Таким образом, в ферментере воспроизводится полная кривая роста, но не во времени, а в пространстве.

Рисунок 4.2 – Трубчатый ферментер полного вытеснения:

S0 – концентрация субстрата в поступающей среде, S – концентрация субстрата в вытекающей среде, X0 – начальная концентрация биомассы,

X – концентрация вытекающей биомассы

В настоящее время появились ферментационные аппараты, обеспе­чивающие процессы с режимом, приближающимся к полному вытесне­нию и при аэробном культивиро­вании. Это вращающиеся трубча­тые реакторы с насадкой или внут­ренними аэрирующими элемента­ми, а также многосекционные ко­лонные аппараты.

Процесс полного вытеснения применяется в промышленности в тех случаях, когда желательно из­бежать потери времени па опорож­нение, стерилизацию и заполнение емкости. Его применяют в пище­вой промышленности, когда ис­пользуются сложные среды и стоит задача наиболее экономично про­вести процесс, аналогичный тому, который ведется в периодиче­ском режиме.

Пример практического применения трубчатого ферментера — анаэробная стадия при производстве пива в башенных проточных емкостях. В этом случае не требуется аэрирования и процесс идет без перемешивания. Если этот процесс аэробный, то его ве­дут в батарее аэрируемых ферментеров (рис. 4.3). При этом кривая роста периодической культуры распределяется но ходу батареи.

Рисунок 4.3 – Рост микроорганизмов в батарее аэрируемых ферментеров

(I – III). Обозначения на рисунке 2

Процесс полного смешения. В процессе полного смешения рост культур происходит в емкости — ферментере при интенсивном перемешивании. Перемешивание достигается продуванием воздуха или работой мешал­ки (или тем и другим одновременно). Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. Этот метод культивирования получил название гомогенно-непрерывного. В ферментере создаются условия, соответствующие одной точке кривой роста культуры. При больших потоках среды эти условия близки к быстрому экспоненциальному росту, при малых -- приб­лижаются к условиям стационарной фазы роста культур. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры — от начала замедления роста после экспоненциальной фазы и до конца стадии замедления роста. В установившемся режиме скорость потока среды, отнесенная к единице объема культуры в ферментере, называется коэффи­циентом разбавления D. Она равняется удельной скорости роста µ. При этом культура находится в устойчивом стационарном состоянии (динамическое равновесие, D = µ) и обладает способностью самопроизвольно автоматически подстраиваться к изме­нениям условий.

Если условия изменятся таким образом, что рост ускорится, то в ферментере повысится концентрация биомассы (х) и пони­зится концентрация субстрата (s). Если рост замедлится, кон­центрация биомассы понизится, а остаточное содержание лими­тирующего рост субстрата повысится.

Если изменения условий временные, то при возвращении к исходным установится исходное стационарное состояние. На из­менения скорости потока культура реагирует соответствующим изменением концентрации биомассы и остаточной концентрации субстрата, ограничивающей рост, не выходя из стационарного состояния. При неизменности условий проточные культуры способны к полной воспроизводимости концентрации биомассы. Но при таком способе культивирования нельзя получить устойчивого состояния только при максимальной скорости роста. Повышение скорости потока или взаимодействие, замедляющее рост, при­водит к тому, что скорость роста (µ) окажется меньше коэффи­циента разбавления (D) и культура вымоется из ферментера. Воспроизведение в потоке определенной точки кривой роста культур широко применяется в промышленности при наращива­нии биомассы микроорганизмов. Хорошо отработанный периоди­ческий процесс выращивания экономически выгодно воспроиз­водить в проточном варианте, так как культура непрерывно находится в состоянии максимальной активности нужного про­цесса, не тратится время на освобождение, заполнение емкостей и на лаг-фазу.

При наращивании биомассы в проточных условиях процесс стремятся вести при возможно большей скорости потока, но не настолько большой, чтобы в среде оставался недоиспользован­ный субстрат. Ограничивающим фактором часто является ин­тенсивность аэрации. Из-за слабой растворимости молекулярного кислорода следует применять только такую концентрацию суб­страта, которая может быть использована при доступной для данной аппаратуры степени аэрирования. При необходимости переработать высокие концентрации субстрата применяется ба­тарея ферментеров, в каждом из которых успевает использовать­ся только его часть. Чем выше концентрация субстрата, тем больше ферментеров необходимо иметь в батарее. При всех про­цессах, связанных с фазой роста культур, считается целесообраз­ным применение проточного культивирования, как более эконо­мичного с технологической точки зрения.

Если периодический процесс идет без учета действия лимити­рующих и ингибирующих факторов, то эта неопределенность останется и при переводе его на непрерывный режим. При раз­ных скоростях потока рост культур может быть ограничен раз­ными факторами. Недостаток одного компонента питания при одной скорости роста может смениться недостатком другого ком­понента при другой скорости и притом без ведома эксперимен­татора. При наращивании биомассы на сложных средах иногда нет необходимости выявлять смену лимитирующих факторов при разных скоростях потока. Это возможно в тех случаях, когда хотят воспроизвести в проточных условиях хорошо отработанный периодический процесс.

Хемостатное культивирование. Хемостатное культивирование — это вариант гомогенного проточного культивирования с заданным желаемым коэффици­ентом разбавления (D), к которому подстраивается скорость рос­та культур (µ). Последняя может быть минимальной или близ­кой к максимальной. При этом задается также фактор, который обусловливает ограничение концентрации вырастающей био­массы. Концентрация биомассы определяется одним определен­ным компонентом питания. При низком коэффициенте разбавления лимитация, т. е. голодание, будет сильной, при высоком — слабой. То же наблюдается и в отношении отравления микро­организмов ингибиторами: при низком коэффициенте разбавле­ния клетки долго соприкасаются с ингибитором и бывают силь­но отравлены, при высоком они недолго пребывают в фермен­тере и отравлены в слабой степени. Однако при высокой скорости роста клетки могут быть более чувствительны к ингибитору.

Хемостатный метод культивирования незаменим в лаборатор­ных исследованиях физиологии микроорганизмов и клеток тка­ней. В промышленности он применяется при наращивании мик­робной биомассы, если известно, какой именно фактор ограни­чивает рост.

Варианты хемостатного культивирования. Хемостатный метод имеет большое количество вариантов. Одностадийное культивирование применяется при необходимости воспроизвести любую скорость роста культур, кроме максималь­ной. Двухстадийное культивирование в двух последовательных ферментерах позволяет наблюдать культуры при максимальной скорости роста и создать условия для ее превышения. Для этого в первом ферментере ведется культивирование при D<µ_m, а во второй подается культура из первого и добавляется свежая сре­да (рис. 4.4). Во втором ферментере происходит повышение ско­рости протока вплоть до превышения µ_m, а вымывания не проис­ходит, так как из первого ферментера непрерывно поступает культура.

Рисунок 4.4 – Двухстадийный хемостат с дополнительной подачей во вторую стадию (А); двухстадийный хемостат (Б):

S₀ – концентрация субстрата в подаваемой среде, S₁ – в первом ферментере, S₂ – во втором ферментере, X₁ – концентрация клеток в первом ферментере, X₂ – во втором ферментере

Максимальная скорость роста может быть достигнута при турбидостаточиом методе регулирования, который является ва­риантом хемостатного, в этом случае скорость потока среды уста­навливается не экспериментатором, а автоматически, по сигналу датчика, регистрирующего концентрацию клеток. Для этого фер­ментер должен иметь устройство для нефелометрического изме­рения мутности, зависящей от концентрации клеток (х) и для регулирования скорости потока среды так, чтобы х оставалось постоянным. Этот метод культивирования позволяет поддержи­вать культуру в устойчивом состоянии па границе вымывания из ферментера, так как при снижении концентрации клеток пе­рестает подаваться среда. Турбидостат дает возможность изу­чать влияние внешних факторов па максимальную скорость роста культур и на состояние клеток при этом (рис. 4.5).

Рисунок 4.5 – Схема турбидостата. Подача среды осуществляется по «команде» нефелометра, измеряющего концентрацию клеток в контуре, по которому насосом прокачивается культура из ферментера:

S₀ – концентрация субстрата в подаваемой среде, S₁ – в первом ферментере, S₂ – концентрация субстрата в вытекающей культуре, X – концентрация клеток

Сигналом для подачи среды может быть не только плотность (мутность), но и любой параметр сре­ды, измеряемый электродом или дру­гим устройством, переводящим величи­ну измеряемого параметра в величину электрического потенциала. Последний усиливается и приводит в действие ра­боту насоса, подающего раствор или питательную среду. Для процессов культивирования, имеющих прямую связь между приростом биомассы и из­менением значения рН среды (напри­мер, при потреблении физиологически кислого соединения азота), использует­ся рН-статный способ управления ско­ростью потока среды. Скорость потока с помощью автоматических устройств уравнивается со скоростью измене­ния рН растущей популяцией, а следо­вательно, и со скоростью роста куль­тур. Это обеспечивает поддержание рН па заданном уровне, а скорость роста является максимальной в данных условиях. Изме­няя условия, можно проследить за соответствующими изменения­ми максимальной скорости роста культур.

В двухстадийиой системе можно воспроизвести во втором ферментере вторую фазу роста периодической культуры, свя­занную с синтезом вторичного продукта метаболизма. В первом ферментере ведется выращивание культуры при большой скорос­ти роста, что соответствует первой фазе периодической культуры. Второй ферментер берется большего размера или содержит боль­ше среды. Поэтому поступающая из первого ферментера куль­тура оказывается в условиях замедленного роста в такой степе­ни, в какой во втором ферментере содержится больше среды, чем в первом. Скорость роста во втором ферментере должна со­ответствовать скорости роста во второй фазе, оптимальной для синтеза вторичного продукта.

При низких концентрациях субстрата и при низкой концент­рации клеток можно возвратить в ферментер часть вытекающей из него биомассы; возврат повышает ее концентрацию и ускоря­ет процесс. Вариантов возврата биомассы может быть несколько. Сепарируют вытекающую культуру и сгущенную часть возвра­щают в ферментер. Устанавливают различные фильтрующие уст­ройства, позволяющие вытекать культуральной жидкости, но за­держивающие клетки. Известны и другие методы культивиро­вания:

1. Отъемно-доливной метод. Среда подается в проточный ферментер порциями. Отъем культуры также производится пор­циями или происходит постоянный слив. Кривая концентрации клеток приобретает вид гребенки.

2. В практике стерильного наращивания патогенных бактерий для получения вакцин применяют многократное выращивание без стерилизации перед каждым циклом. Из ферментера после окон­чания цикла роста сливается не вся культура (небольшая часть остается). К ней добавляется стерильная среда и цикл наращи­вания повторяется. Так ведут несколько циклов.

3. Продленная периодическая культура, или метод подпитки. К периодической культуре добавляются компоненты питания — обычно соединение углерода по мере его исчерпания. Культура не страдает от избытка соединения углерода в начале роста, что неизбежно в обычной периодической культуре, и сразу начинает быстрый рост, который идет с постоянной скоростью до полного исчерпания всех компонентов питания.

Другой способ продления роста —- это диализ. Культивиро­вание ведут в гильзе, не проницаемой для клеток, но пропускаю­щей растворенные вещества. Гильза с культурой погружена в питательную среду, которая может быть проточной. Из среды поступают компоненты питания и в нее же выносятся продукты метаболизма. Таким путем получают сильно концентрированную биомассу.

Основные методы культивирования микроорганизмов пред­ставлены на схеме (рис. 4.6).

Рисунок 4.6 – Основные методы культивирования микроорганизмов

Стадии разработки биотехнологичесого производства - лабораторный регламент (подбор штаммов, субстратов, условий культивирования, конструкции биореактора, способов выделения и оценки качества конечного продукта, технологическая схема), опытно-промышленное испытание (масштабирование в условиях полупромышленных производств), промышленное производство (масштабирование)

Все биотехнологические производства по их направленности делятся на две группы. Первая преследует цель получения мак­симально возможных количеств биомассы, а вторая - максимум выхода продуктов жизнедеятельности клеток (метаболитов). В первом случае - это могут быть живые клетки (например, хлебопекарные дрожжи), био­масса нежизнеспособных клеток как источник кормового белка, витами­нов, споры с токсинами (препараты для защиты растений от вредителей). Во втором - органические кислоты, ферменты, аминокислоты, антибиоти­ки. При этом клетки продуцента являются отходом производства, тре­бующим утилизации.

Несмотря на различные цели, общая схема биотехнологического производства в обоих случаях может быть представлена в виде пяти основных стадий:

- подготовка питательной среды для культивирования промышленного микроорганизма;

- получение чистой культуры для внесения в основной аппарат - фермен­тер;

- основная ферментация;

- выделение и очистка конечного продукта;

- получение товарных форм препарата.

Постановка задачи масштабирования.Изучение процессов ферментации в лабораторных условиях происходит сначала в колбах, затем в ферментерах лабораторного масштаба объемом 1 — 10 л, далее происходит испытание в опыт­ных установках объемом 50, 100, 1000 л и более. Объемы промыш­ленных установок зависят от вида продукта и от потребности в нем. Обычно речь идет уже о десятках кубометров — 10, 20, 50, 60, 100, отдельные аппараты имеют объемы свыше 1000 м³ (для полу­чения кормовых дрожжей).

Обычно в аппаратах разного масштаба используют одинаковые микроорганизмы и одинаковый состав питательных сред. Можно было бы ожидать, что в пересчете на единицу объема — литр, ку­бометр, миллилитр — количество получаемого продукта (биомас­сы или продуктов метаболизма) будет одинаковым или почти оди­наковым в аппаратах разного масштаба.

Действительность, однако, не оправдывает таких прогнозов. Наоборот, очень часто в аппаратах разного масштаба и конструк­ции результаты процесса различаются, иногда в несколько раз.

В связи с этим в производственной практике возникает пробле­ма масштабирования.

Масштабирование — это воспроизведение результатов, полу­ченных на оборудовании одного размера (или одной конструк­ции), при проведении того же процесса в аппаратах другого (обычно большего) размера или другой конструкции.

Обиходный пример масштабирования дан в книге Джонатана Свифта «Путешествия Гулливера». Гулливер оказался пленником лилипутов, и у них возникла проблема кормления Гулливера. Их специалистами по масштабированию был разработан критерий масштабного перехода: Гулливеру давали 1728 лилипутских пор­ций. Происхождение этой цифры таково. Гулливер был в 12 раз крупнее (т. е. выше ростом), чем лилипут. Очевидно, что масса и объем Гулливера и лилипута соотносились как 123: 1 = 1728.

Масштабирование оказалось удачным: Гулливер совершал мно­жество всяких подвигов и в конце концов освободился от плена.

Другой пример не столь удачен, хотя по существу использовал­ся тот же принцип масштабирования — по массе. Биологическая лаборатория в США проводила испытание действия препарата ЛСД на различных животных. Как обычно принято при испыта­нии лекарственных средств, сначала испытания проводят на мел­ких животных (мышах, крысах, кошках, кроликах), а затем пере­носят их на крупных животных и даже на человека; при подборе дозировки исходят из массы тела. Испытав препарат ЛСД на кош­ках, назначили дозировку для слона с учетом их разницы в весе в 30 000 раз. Результат оказался отличным от ожидаемого: слон за­шатался и упал замертво, свидетельствуя тем самым, что проблема масштабирования не столь однозначна, как кажется.

Вернемся теперь к нашему процессу — процессу ферментации. Соотношение массы культуральной жидкости, например, в колбе (100 мл) и в производственном аппарате объемом 63 м³ (объем жидкости 45 м³) равно 450 000 : 1 — даже больше соотношения кошка: слон. Между тем именно с таким соотношением реально приходится работать, если не хочется осложнять себе жизнь и тра­тить время и деньги на испытания в большом ряду аппаратов про­межуточных емкостей.

Подход к масштабированию на основе концентрации растворенного кислорода. Основные предпосылки. Поскольку ход процесса определяется микроорганизмами, различия в ходе ферментации в аппаратах разного масштаба и конструкции следует искать в микроокруже­нии микробных клеток. Концентрации питательных веществ, продуктов метаболизма, температура и рН вряд ли зависят от мас­штаба. Более естественным выглядит предположение о различии в концентрациях растворенного кислорода С.

Аэробные микроорганизмы не могут развиваться в отсутствие кислорода. Однако растворимость кислорода воздуха в воде очень невелика — 7 мг/л при 20°С. Если жидкость (или среду) полностью насытить кислородом воздуха, а затем прекратить аэрацию, то мно­гие промышленные культуры микроорганизмов «съедают» этот запас за 5—10 с. Поэтому требуется непрерывная подача воздуха в аппарат.

Надо заметить, что растворимость кислорода зависит еще и от давления воздуха, а вернее, от парциального давления кислорода в газовой фазе. Если, например, повысить давление воздуха в 2 раза, то и концентрация растворенного кислорода при насыщении жид­кости воздухом также повысится в 2 раза. Если вместо воздуха для насыщения среды использовать чистый кислород, то концентрация растворенного кислорода возрастет почти в 5 раз — пропорцио­нально парциальному давлению кислорода в воздухе и газообраз­ном кислороде: (100 %) / (21 %) — 4,8. Этот показатель — концентрацию растворенного кислорода — можно измерять с помощью специального датчика растворенного кислорода. Это очень важный прибор для процессов ферментации, хотя в обычных системах контроля и автоматизации химических производств он используется довольно редко.

Профили изменения концентрации растворенного кислорода во времени. Концентрации растворенного кислорода, которые мы ука­зывали ранее, — это концентрации в равновесном состоянии, при насыщении. В реальном процессе происходит непрерывное по­требление растворенного кислорода из жидкости и одновременно его непрерывное растворение — массопередача из пузырей воздуха. Надо иметь в виду важную особенность микробиологических процессов. Микроорганизмы не способны потреблять кислород напрямую из газовых пузырей. Они потребляют лишь растворен­ный кислород, т. е. кислород переходит в клетку микроорганизма через две ступени: массопередача из газа в жидкость и затем по­требление уже растворенного кислорода из жидкости.

Чтобы повлиять на концентрацию растворенного кислорода в жидкости, необходимо изменить либо скорость продувания возду­ха через аппарат, либо частоту вращения мешалки в аппарате; либо давление в нем.

Мы можем наблюдать за ходом изменения концентрации ра­створенного кислорода непрерывно в течение всей ферментации. Обычный ход кривой C(t) представлен на рисунке 4.7.

Рисунок 4.7 – типичный профиль изменения концентрации растворенного кислорода во времени в ходе периодической ферментации

Эта кривая (профиль во времени) отражает разные потребнос­ти кислорода в разные периоды ферментации и, соответственно, баланс между подводом кислорода и его потреблением.

Можно, конечно, меняя скорость подачи воздуха и частоту вращения мешалки, поддерживать профиль во времени, напри­мер, в большом аппарате таким же, как в малом.

А можно вспомнить о том, что кислород, как и другие субстраты, влияет на процесс обычно по кривой с насыщением (рис. 4.8). Тогда в ходе процесса достаточно поддерживать величину OQp. Обычно зависимость выхода за весь процесс ферментации (Р или X) от поддерживаемой концентра­ции растворенного кислорода имеет вид графика, представленного на рисунке 4.9.

Рисунок 4.8 – Влияние концентрации растворенного кислорода на удельную скорость биосинтеза целевого продукта

Рисунок 4.9 – Влияние концентрации растворенного кислорода на выход продукта или биомассы микроорганизмов

Повышение концентрации раство­ренного кислорода выше некоторой ве­личины Скр не ухудшает процесс, но из экономических соображений удобно держать концентрацию поменьше. При высоких концентрациях в аппарат пода­ется больше воздуха, больше скорость вращения мешалки, иногда приходится увеличивать давление и даже добавлять в воздух кислород.

Есть процессы, хотя их и немного, в которых повышение концентрации растворенного кислорода хуже не просто из-за перерасхода воздуха и энергии, но также и из-за снижения выхода (показано пунктиром на рисунке 4.9).

Так в общем выглядит способ масштабирования процесса пу­тем поддержания профиля растворенного кислорода во времени.

Проблема в том, что обслуживание датчика и прибора для изме­рения растворенного кислорода — довольно хлопотное дело, и часто на заводах их либо нет, либо отказываются от их регулярной эксплу­атации.

Связь концентрации растворенного кислорода с условиями массопередачи. Как бы сделать так, чтобы этот профиль в аппарате большего масштаба выдерживался сам собой? Какую характерис­тику нужно поддерживать одинаковой в сравниваемых аппаратах, чтобы одинаковым был и кислородный профиль?

Для ответа на этот вопрос рассмотрим основное уравнение массопередачи кислорода в ферментере

Qo₂ = K_La (C* - C), (4.1)

где Qo₂— скорость потребления кислорода единицей объема среды (кинетический параметр, аналогичный Qs для не газообразного субстрата); K_La — объемный ко­эффициент массопередачи по кислороду; С* — концентрация растворенного кис­лорода при насыщении; С — текущая концентрация растворенного кислорода.

Уравнение показывает, что в текущий момент времени ско­рость потребления кислорода равна его скорости растворения в жидкости из газового потока.

Интересно, что коэффициент K_La включает в себя площадь межфазной поверхности, поэтому его размерность включает в себя единицу объема.

Размерность Qo₂ :

Размерность С и С:

Отсюда получается размерность для величины K_La:

Из уравнения (1) легко получить выражение для текущей концентрации растворенного кислорода С:

(4.2)

Если в ходе процесса скорость потребления кислорода Qo₂, из­меняется во времени, то изменяется и концентрация растворенно­го кислорода, что и дает наблюдаемый профиль во времени.

Если мы имеем два разных аппарата, в которые загружена одна и та же культуральная жидкость, имеющая одну и ту же скорость потребления кислорода на единицу объема, то концентрация ра­створенного кислорода в таких аппаратах зависит