Предферментационная стадия

На этой стадии осуществляется хранение и подготовка культуры продуцента (инокулята), подготовка и получение питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологических и рециркулируемых воды и воздуха.

Компоненты питательных сред подбирают на основании расчета материального баланса, связанного с трансформацией того или иного источника питания в клеточную биомассу и/или метаболит при учете расходуемой (выделяемой) энергии. Обычно качественный и количественный состав питательных сред указан в регламентной документации.

Поддержание и подготовка чистой культуры является очень важным моментом предферментационной стадии для получения целевых продуктов: чаще всего это биомасса микроорганизмов - продуцентов. Таковыми являются бактерии и низшие грибы, однако иногда в качестве продуцентов могут выступать клетки высших эукариот (насекомых, млекопитающих, растений).

Продуцент, его физиологобиохимические характеристики и свойства определяют эффективность всего биотехнологического процесса. В отделении чистой культуры осуществляют хранение производственных штаммов и обеспечивают их реактивацию и наработку продуцента в количествах, требуемых для начала процесса. Промышленный штамм в идеале должен удовлетворять следующим основным требованиям:

1) стабильности структурно-морфологических признаков и физиологической активности и эксплуатации в производстве;

2) повышенной скорости роста и биосинтеза целевого(-ых) продукта(ов);

3) достаточно широкому диапазону устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (колебания температуры, рН, перемешиванию, вязкости среды);

4) умеренной требовательности к ограниченному числу источников питания; чем более широкий набор источников углерода, азота и других элементов может использовать производственный штамм, тем легче его культивировать, и с большей выгодой.

При выращивании посевных доз инокулята применяют принцип масштабирования, т. е. проводят последовательное наращивание биомассы продуцента в колбах, бутылях, далее в серии последовательных ферментеров. Каждый последующий этап данного процесса отличается по объему от предыдущего обычно на порядок. Полученный продуцент по стерильной посевной линии направляется далее в аппарат, в котором реализуется ферментационная стадия.

Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и совместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их состав входят нерастворимые компоненты. В различных биотехнологических процессах применяются разные по происхождению и количествам субстраты, поэтому процесс их приготовления варьируют.

Дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется индивидуально на каждом производстве в соответствии с технологическим регламентом конкретного процесса. В качестве дозирующего оборудования при этом применяются весовые и объемные устройства, используемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментаторы с помощью вакуумных насосов.

Часто применяют принцип предварительных смесей, т.е. соли предварительно растворяют и затем транспортируют по трубопроводам, дозируя их подачу по объему.

Ферментация

Стадия ферментации является основной стадией в биотехнологическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов. Эта стадия осуществляется в биохимическом реакторе (ферментере) и может быть организована различными способами в зависимости от особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта.

Технологическое оформление процессов промышленной биотехнологии в значительной мере определяется отношением микроорганизма-продуцента к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и нормы технологического режима подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и оптимальных для данной культуры в данной фазе роста.

Промышленное использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного исключения кислорода из среды, поэтому процессы этого типа (брожение) технологически проще аэробных. В начальной фазе этих процессов требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.

Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для процессов брожения, так как в этом случае необходимо полностью исключить возможность попадания кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую среду.

Вопросы термостатирования ферментационного процесса (подвода или отвода тепла в ходе ферментации) являются очень острыми в целом ряде производств биотехнологии. В аэробных условиях микробиологический синтез протекает со значительным тепловыделением, что вызывает необходимость отвода тепла из аппаратов большого объема (сотни и тысячи кубометров). Технологические требования к скорости теплоотвода очень жесткие из-за узкого температурного оптимума роста культуры. Наиболее приемлемый на практике способ теплоотвода - охлаждение водой через змеевики, рубашки и др. устройства - осложняется небольшой разностью температур между содержимым биореактора (32-34^оС для дрожжей Candida) и охлаждающей водой (20^оС), температура которой в жаркое время года еще выше. Поэтому в реакторе создается развитая поверхность газообмена, увеличивается скорость движения жидкостей и т.д.

Важно также поддерживать определенный состав питательной среды. В непрерывных процессах биосинтеза задача технолога сводится к поддержанию концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы на заданном уровне. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в периодическом режиме является изменение концентраций компонентов среды и её рН, а также введение необходимых добавок по заранее разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле ферментации. Этот способ относительно прост и легко поддается автоматизации.

Во многих случаях необходимо возможно полно исчерпывать компоненты питательной среды, чтобы они не попадали на последующие стадии переработки. Эта необходимость может быть вызвана рядом причин:

- дороговизна или дефицитность субстрата;

- вредное воздействие субстрата на качество готового продукта (например, при производстве дрожжей на парафинах, когда выделение остаточных количеств углеводородов из клеточной массы затруднено, поэтому добавляют дополнительные секции для дозревания или утилизации запасенных в цитоплазме углеводородов);

- затруднения, возникающие на стадии выделения и очистки метаболитов при одновременном присутствии в культуральной жидкости неутилизированных веществ.

Ферментация может происходить в строго асептических условиях или без соблюдения правил стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на жидких и твердых средах, анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация может протекать, в свою очередь, поверхностно или глубинно (во всей толще питательной среды). Культивирование биологических объектов может осуществляться в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом.

В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания (рис. 2). При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды.

Рис. 2. Кривая роста микроорганизмов в ходе периодической ферментации: 1 - лаг-фаза; 2 - фаза экспоненциального роста; 3 - фаза линейного роста; 4 - фаза замедления роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза отмирания

Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты - ферменты, аминокислоты, витамины, т. е. вещества, которые требуются для роста культуры клеток) и стационарной (вторичные метаболиты - антибиотики, алкалоиды, гормоны, токсины - низкомолекулярные вещества, не требующиеся для роста культуры, но необходимые для функционирования зрелой популяции, часто выполняющие защитную функцию) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия для максимального производства того или иного целевого продукта.

Непрерывная ферментация биообъектов осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны, т. е. в стационарной фазе. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения.

При непрерывной ферментации в ферментерах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии.

Обеспечение процесса ферментации с точки зрения инженерной реализации сводится к дозированному поступлению в ферментер потоков (инокулята, воздуха или газовых смесей, питательных биогенных элементов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также к измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта.

В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов.