Получение растений-регенерантов

Индукция стеблевого органогенеза или соматического эмбриогенеза позволяет получить растения-регенеранты. Посредством стеблевого органогенеза растения регенерируют из каллюсных культур, а также непосредственно из клеток эксплантата: путем индукции адвентивных почек или из пазушных почек стеблевых черенков. Адвентивные (придаточные) почки образуются у интактных растений не на верхушке побега или в пазухе листа, а на различных органах растения (корнях, листьях, стеблях). При этом они не связаны с апикальными меристемами, а формируются из различных тканей, как поверхностных, так и глубоко расположенных. Использование культуры клеток позволяет получать адвентивные побеги из эксплантатов листа, клубня, стебля и других частей растения в больших количествах. То же относится к индукции побегов из пазушных почек стеблевых эксплантатов. Получение растений-регенерантов из пазушных и адвентивных почек - основные методы вегетативного (клонального) размножения растений in vitro. Образовавшиеся из почек побеги отделяют от эксплантата, укореняют на питательной среде с ауксинами (или без регуляторов роста), затем переносят в условия in vivo, где из них выращивают взрослые растения.

Соматический эмбриогенез индуцируют в суспензионной культуре клеток, у каллюсных культур, в культуре пыльников. Образовавшиеся эмбриоиды переносят на питательную среду без гормонов, где при культивировании на свету из эмбриоидов развиваются пробирочные растения, которые после подращивания высаживают в грунт. Соматический эмбриогенез также представляет интерес для клонального размножения растений. Подробно методы клонального размножения растений in vitro будут рассмотрены в главе 5.

Заключение

Клетки формирующегося зародыша растений являются недифференцированными. Они интенсивно делятся и могут давать начало различным тканям и органам растения. В процессе дифференциации клетки становятся специализированными; при этом они теряют способность к делению. Лишь клетки меристем сохраняются в эмбриональном состоянии. Однако у растений при определенных условиях, например, при поранении, могут возникать новые, вторичные меристемы. Раневые меристемы дают начало каллюсу – особой ткани, состоящей их недифференцированных паренхимных клеток, которые, интенсивно делясь, покрывают место поранения. В процессе их вторичной дифференцировки происходит восстановление поврежденных тканей и органов.

Процесс каллюсообразования и регенерации тканей, органов и целого растения из дифференцированных специализированных клеток может быть воспроизведен в культуре клеток растений на искусственных питательных средах, содержащих определенные фитогормоны или регуляторы роста. Процесс дедифференциации специализированных клеток индуцируют ауксины. Однако для того, чтобы дедифференцированные клетки начали делиться, необходимы цитокинины. Начальным условием в этом процессе является дедифференцировка: утрата специализации клеток ткани и восстановление их способности к делению. В результате дедифференцировки происходит существенное изменение метаболизма клеток. Клетки эксплантатов теряют запасенные липиды, крахмал, белки. Фотосинтезирующие клетки утрачивают хлорофилл и липиды хлоропластов. При этом возрастает количество амилопластов, разрушается аппарат Гольджи, перестраивается эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета. Энергетический метаболизм каллюсных клеток в значительной мере напоминает таковой у клеток меристемы. Митохондрии у них слабо развиты, в них мало крист, что оказывает негативное влияние на активность аэробного дыхания. Они потребляют меньше кислорода по сравнению со специализированными клетками растения. У них происходит сдвиг соотношения между дыханием и брожением в сторону брожения.

В отличие от меристемных клеток, для которых характерны высокая однородность и генетическая стабильность, рост каллюсных клеток, их вторичная дифференцировка происходят неорганизованно и асинхронно. В каллюсной ткани одновременно присутствуют клетки, находящиеся на разных стадиях митотического цикла. Культура каллусных тканей характеризуется цитогенетической нестабильностью: изменением плоидности клеток, появлением хромосомных аберраций и точковых мутаций.

Деление клеток в культуре in vitro требует присутствия в питательной среде фитогормонов или синтетических регуляторов роста. Однако при длительном культивировании могут возникать клетки со стойкой дедифференцировкой, характерной особенностью которых является гормононезависимость. Гормононезависимостью характеризуются и культуры опухолевых клеток корончатого галла. Установлено, что это заболевание вызывают агробактерии, которые способны трансформировать клетки растений путем переноса и встраивания в их геном фрагментов ДНК бактерий, несущих гены, кодирующие биосинтез ауксинов и цитокининов.

В процессе культивирования клетки могут сохранять стойкую дедифференцировку, либо претерпевать вторичную дифференцировку, сопровождающуюся гистогенезом (образованием в каллюсе различных тканей) или морфогенезом (возникновением организованных структур). Морфогенез проходит в виде органогенеза или соматического эмбриогенеза. Органогенез – это регенерация в культуре клеток in vitro отдельных органов растения: стеблей, корней, реже - флоральных элементов, зачатков листьев. Соматический эмбриогенез – образование эмбриоидов, то есть структур, напоминающих зиготические зародыши. Как органогенез, так и соматический эмбриогенез могут иметь место не только в культуре клеток, но и в растениях in vivo, а также в культуре in vitro непосредственно из эксплантата (прямой морфогенез).

Способность отдельных клеток растений менять программу развития, претерпевать дедифференцировку, вторичную дифференцировку и, в результате, давать начало целому растению, то есть реализовать заключенную в них генетическую информацию, получило название тотипотентности.

Наиболее мощным индуктором органогенеза является изменение соотношения между концентрациями цитокининов и ауксинов, входящими в состав питательных сред. Ф. Скуг и К. Миллер показали, что при культивировании каллюса на питательной среде, содержащей ауксин и цитокинин приблизительно в равных молярных концентрациях имеет место интенсивная пролиферация клеток, при преобладании цитокининов над ауксинами часто начинается стеблевой органогенез, а в случае преобладания ауксинов – корневой. Органогенез в каллюсной ткани начинается с того, чтопод влиянием соответствующих воздействий (прежде всего, при изменении соотношения концентраций ауксинов и цитокининов в питательной среде) компетентная клетка или группа компетентных клеток обособляются от окружающих их каллюсных клеток, образуя зоны повышенной митотической активности – меристемоиды. В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и, соответственно, происходит стеблевой, корневой, листовой или флоральный органогенез.

Для индукции соматического эмбриогенеза обычно необходимо присутствие в питательной среди ауксина (чаще всего это 2,4-Д). Считается, что ауксин изменяет полярность компетентных клеток, что приводит к последующим ассиметричным делениям. Мелкие дочерние клетки, образовавшиеся в результате ассиметричного деления являются эмбриогенными (детерминированными к эмбриогенезу). В результате деления эмбриогенных клеток формируется глобулярный проэмбрио. Условием его дальнейшего развития является перенос культур на питательную среду, содержащую пониженные концентрации ауксинов, или на полностью безгормональную среду.

В результате стеблевого органогенеза образуется однополярная структура, содержащая апикальную меристему стебля. Образовавшиеся в культуре клеток проростки можно укоренить (in vitro или in vivo) и получить, таким образом, целое растение. В результате соматического эмбриогенеза формируется двуполярная структура (эмбриоид), которая содержит как стеблевую, так и корневую меристему. В культуре in vitro при определенных условиях эмбриоиды также способны развиться в растение.

Основные типы культуры клеток растений – каллюсная (культивирование производится на агаризованной питательной среде), суспензионная (глубинное культивирование на жидких средах при искусственной аэрации культур) и культура протопластов (культура клеток, лишенных целлюлозной оболочки). Суспензионную культуру легче всего получить из каллюсной. Клетки, культивируемые в суспензии, можно высеять на агаризованную питательную среду, чтобы получить каллюсную культуру. Протопласты до восстановления клеточной стенки, начала клеточных делений и образования колоний культивируют на жидких питательных средах, затем колонии переносят на агаризованную питательную среду и получают каллюсную культуру. Индукцию морфогенеза и получение растений-регенерантов чаще всего производят из каллюсной культуры клеток.

Разработаны методы культивирования единичных клеток и протопластов, основанные на кондиционировании питательных сред, оптимизации их состава и применении приемов культивирования клеток в малых объемах питательной среды. Опыты по получению растений-регенерантов при культивировании единичных соматических клеток растений предоставили прямое доказательство гипотезы Г. Габерландта о тотипотентности растительной клетки. Эти методы имеют большое практическое значение для разделения в пространстве различных клеточных вариантов (клеточных линий), присутствующих в культуре клеток, дальнейшего получения из них измененных растений-регенерантов (мутантов, соматических гибридов).

Дополнительная литература

1. Bhojwani S.S., Razdan M.K. Plant tissue culture: theory and practice. Elsevier. 1996.- 767 p.

2. Plant cell and tissue culture (Ed.: I.K. Vasil and T.A. Thorpe). Springer. 1994.- 593 p.

Контрольные вопросы

1. Чем вторичные меристемы отличаются от первичных?

2. Какие фитогормоны индуцируют переход специализированной клетки растений к дедифференцировке?

3. Какие изменения в структуре и метаболизме клеток происходят при дедифференцировке?

4. В чем заключаются различия в гормононезависимости «привыкших» и опухолевых клеток растений?

5. По каким параметрам оценивают интенсивность роста и жизнеспособность клеток суспензионных культур?

6. Для какой цели вводят в питательную среду осмотики при получении протопластов?

7. Какие основные подходы используют для индукции делений и получения растений-регенерантов в культуре единичных клеток и протопластов?

8. В какой форме может проходить вторичная дифференцировка в культуре клеток растений?

9. Какие основные факторы индуцируют переход клеток к органогенезу в культуре in vitro?

10. Опишите процессы, происходящие при соматическом эмбриогенезе в культуре клеток растений.

11. Чем отличаются проростки, регенерированные в культуре клеток с помощью стеблевого органогенеза и соматического эмбриогенеза?