Культура протопластов растений

Изолированный протопласт – это часть клетки, которая остается после удаления клеточной стенки. Э. Коккинг (Cocking 1960) из Ноттингемского университета предложил метод энзиматического удаления клеточной стенки, который позволяет получать большое количество протопластов, осуществлять их культивирование in vitro. Для удаления клеточной стенки в настоящее время используют целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы, получаемые из грибов – Myrothecium, Aspergillus, Trichoderma и других, из пищеварительного сока улитки Helix pomatia.

Протопласты выделяют из разных тканей растений, а также из клеток каллюсных и суспензионных культур. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев. Наиболее освоены методы изоляции и культивирования протопластов у представителей семейства Solanaceae и отдельных видов Brassica. Трудными объектами для получения протопластов, способных к реализации тотипотентности, являются однодольные растения, в том числе злаки, а также хвойные.

Регуляция водообмена клетки связана с наличием клеточной стенки. Выживание клетки, лишенной клеточной стенки, возможно лишь при создании оптимума осмотических свойств среды выделения и культивирования протопластов. Для этого клетки и выделенные протопласты поддерживают в плазмолизированном состоянии путем внесения 0,3÷0,8 моль/л осмотических стабилизаторов: сахаров (маннита, глюкозы, сорбита, ксилозы), ионных осмотиков (CaCl₂, KCl). Под действием осмотиков протопласт уменьшается в объеме, принимает сферическую форму (Рис 3.3). Состав и концентрации осмотиков подбираются индивидуально для каждого растительного объекта. Также в зависимости от происхождения растения и взятой для изоляции протопластов ткани подбирается вид ферментов, их комбинация и концентрация. Ниже приведен типичный протокол выделения протопластов из мезофилла листа табака.

Изолированные листья молодых растений стерилизуют в течение 1 мин. в 70%-ном этаноле, а затем в течение 20 мин. в 2%-ном растворе гипохлорита натрия (NaOCl×5H₂O). После промывания листьев стерильной водой у них удаляют нижний эпидермис, крупные жилки и нарезают полосками шириной около 5 мм. Нарезанные фрагменты листьев помещают в чашки Петри в смесь ферментов пектиназы и целлюлазы. Например, для листьев табака используют смесь 0,5 % пектиназы, 2% целлюлазы и 13% сорбитола, рН = 5,4. Инкубируют фрагменты листьев в ферментной смеси в термостате 15-18 часов при 25°С. После этого следует очистка протопластов от остатков клеточных стенок посредством фильтрации через капроновую ткань. Отмывание протопластов от ферментов производится путем трехкратного центрифугирования при 170 g по 2 мин. Отмытые протопласты ресуспендируют в культуральной среде, содержащей 13% маннитола, до концентрации 4×10⁵ протопластов в 1 мл. Плотность протопластов должна быть оптимальной для каждой культуры. Суспензию протопластов переносят в чашки Петри с жидкой или агаризованной средой или культивируют методом микрокапель (будет описан ниже).

Сразу после того, как суспензия протопластов отмыта от раствора ферментов, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Отмечается появление целлюлозных микрофибрилл, постепенно организующихся в типичную клеточную оболочку. Уже через 2-4 дня протопласты утрачивают сферическую форму, что означает полное восстановление клеточной стенки. Протопласты, не регенерировавшие клеточную стенку, теряют способность к нормальному митотическому делению и образованию клеточных колоний. Такие протопласты или не приступают к делению, или в результате их деления формируются многоядерные структуры, так как кариокинез не сопровождается цитокинезом.

Формирование клеточной стенки не всегда является условием, достаточным для перехода клетки к делению. В зависимости от объекта и условий культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 % восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут происходить через 2-10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии после переноса на среду для регенерации могут дать начало растениям-регенерантам как обычные каллюсные культуры.