Суспензионная культура клеток растений

Подобно микроорганизмам клетки растений можно культивировать in vitro не только на полутвердых (агаризованных) питательных средах, но и с использованием жидких сред – в виде суспензии клеток. При таком культивировании обеспечение клеток кислородом достигается путем постоянного перемешивания среды на качалках, роллерных аппаратах или с помощью других приспособлений.

Для получения клеточной суспензии каллюсную ткань помещают в сосуд с жидкой питательной средой (приблизительно 2 г ткани на 100 мл среды). Предпочтительно использовать рыхлые каллюсы, которые легко распадаются на кластеры и небольшие агрегаты клеток. Суспензия перемешивается на качалке со скоростью 100-120 об/мин. В отличие от микроорганизмов получить суспензию одиночных клеток растений достаточно сложно. Поэтому примерно через две недели суспензию фракционируют на одиночные клетки, мелкие кластеры и большие агрегаты каллюсных клеток. Проще всего это сделать с помощью отстаивания суспензии в течение 1-2 минут. Крупные агрегаты оседают на дно, а одиночные клетки и мелкие агрегаты клеток остаются в поверхностной фазе. Чтобы удалить из суспензии крупные агрегаты клеток также используют фильтрование через 1-2 слоя марли, нейлоновые сита.

Улучшить дезагрегацию каллюсных клеток при получении суспензионной культуры клеток можно, предварительно выращивая каллюс на питательной среде без ионов кальция, содержащей в качестве ауксина 2,4 Д. Хороший эффект дает добавление в среду ферментов пектиназы (около 2 мг/л) и целлюлазы (0,01 мг/л). На такой среде суспензию клеток можно получить и непосредственно из эксплантата. Для поддержания деления клеток суспензии в питательной среде должны присутствовать ауксины и цитокинины.

Как и каллюсные культуры, суспензию клеток периодически переносят на свежую питательную среду (пассируют). Для этого суспензию фильтруют через нейлоновое сито и часть объема культуры, содержащего одиночные клетки или мелкие агрегаты - инокулят (inoculum), переносят в стерильных условиях в приготовленную питательную среду. Каждая линия культуры клеток растений характеризуется минимальным объемом инокулята, меньше которого культура не возобновляет рост (чем он меньше, тем лучше линия). Признаками хорошей линии также являются высокая скорость роста в конкретных условиях культивирования, высокая степень дезагрегации (не более 5-10 клеток в группе), морфологическая выравненность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма), отсутствие элементов проводящей системы (трахееподобных элементов).

Рост клеток в суспензионных культурах клеток оценивают по одному или нескольким из следующих параметров.

- Объем осажденных клеток (ООК). Переносят небольшой объем суспензионной культуры в мерную пробирку объемом 15 мл, лучше всего коническую; центрифугируют 5 минут при 200 g. ООК – величина, равная отношению объема осадка к объему суспензии, выраженное в %.

- Число клеток в единице объема питательной среды: подсчитывается в камере Фукса-Розенталя.

- Сырая и сухая масса. Суспензия клеток фильтруется через смоченный и взвешенный фильтр, вложенный в воронку Бюхнера под слабым вакуумом. Клетки промывают дистиллированной водой, оттягивают воду под вакуумом и взвешивают снова вместе с фильтром; сухая масса определяется аналогично, но взвешивается сухой фильтр, а клетки сушат вместе с фильтром в термостате при 60^оС до постоянной массы.

- Содержание белка. Для определения белка клетки собирают на фильтре из стекловолокна, дважды промывают кипящим раствором 70% этанола, сушат ацетоном, гидролизуют 1М NaOH при температуре 85^оС в течение 90 мин; затем фильтруют и определяют белок по Лоури.

- Проводимость среды; ее определяют с помощью кондуктометра – она обратно пропорциональна массе клеток.

- Жизнеспособность клеток. Ее оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью окраски прижизненными красителями (0,5 % раствором синего Эванса или 0,01% раствором флюоресцеиндиацетата): живые клетки не окрашиваются красителями вследствие непроницаемости для них клеточных мембран.

Кривая роста культур клеток имеет S-образную форму (Рис. 3.2). Во время первой, латентной фазы (лаг-фазы) увеличения числа и массы клеток не происходит. Клетки в это время подготавливаются к делениям. Следующая, логарифмическая фаза (экспоненциального роста) характеризуется наибольшей митотической активностью и наибольшим приростом массы клеток. Третья фаза - линейного роста, в которой прирост клеточной массы происходит с постоянной скоростью. Далее наступает фаза замедленного роста и, наконец, ростовая кривая выходит на плато. В этот период интенсивность отмирания каллюсных клеток еще уравновешивается их приростом за счет деления. Однако если не пассировать культуру в этот период на свежую питательную среду, деградация клеток может стать необратимой и культура погибнет.