Культура одиночных клеток и протопластов. Получение колоний из клеточных суспензий

Основное направление использования клеточных суспензий в биотехнологии – производство вторичных метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными препаратами (это направление будет рассмотрено в главе 4). Клеточные суспензии также представляют значительный интерес для разделения в пространстве различных клеточных вариантов, присутствующих в культуре клеток, с целью дальнейшего получения из них измененных растений-регенерантов. В отличие от культуры микроорганизмов, высев суспензии клеток на поверхность агаризованной питательной среды не всегда позволяет получить отдельные колонии от отдельных клеток растений. Трудности связаны с тем, что единичные клетки, или даже относительно большое количество клеток растений в сильно разведенной суспензии, при высеве на агаризованную питательную среду теряют способность к делению, оставаясь при этом живыми. То же происходит и в суспензии клеток, если при ее пассировании инокулят меньше определенного минимального объема, то есть при слишком большом разведении суспензии. Для достижения положительного результата необходимо использовать специальные методы культуры одиночных клеток. Они особенно актуальны для культуры протопластов, в частности, для получения колоний и дальнейшей регенерации растений соматических гибридов (в случае визуального отбора под микроскопом гибридных протопластов, см. гл. 8).

Наибольшее распространение получила методика «плэйтинга» (высева), предложенная Бергманом (Bergmann, 1960). В качестве исходного материала используют хорошо растущую суспензию клеток растений в концентрации в два раза большей, чем предполагается получить при высеве на агаризованную питательную среду. Предварительно суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр, чтобы в ней остались единичные клетки или мелкие клеточные агрегаты. Готовят 0,6–1% агаровую среду того же состава, который был использован для поддержания роста суспензии, нагревают среду для растворения агара и после ее охлаждения до 35^оС перемешивают с равным количеством клеточной суспензии. Смесь разливают в чашки Петри слоем около 1 мм, чашки заклеивают парафильмом (специальной эластичной пленкой, которая предохраняет чашки от контаминации, обеспечивая при этом нормальный воздухообмен). С помощью инвертированного микроскопа определяют местоположение отдельных клеток, которое отмечают маркером на крышках чашек. Проводят культивирование в термостате, периодически наблюдая под микроскопом деление клеток, используя сделанные метки.

Для успешного деления клеток растений в суспензии или при высеве на агаризованную питательную среду важное значение имеет фактор кондиционирования. Было высказано предположение, что интенсивно делящиеся клетки выделяют в питательную среду какие-то вещества (фактор кондиционирования), которые оказывают стимулирующее воздействие на деление соседних клеток. При небольшом количестве клеток на единицу объема питательной среды концентрация таких веществ недостаточна для индукции деления. В экспериментах Бергмана около 20 % одиночных каллюсных клеток табака делилось и образовывало колонии. Это объясняют тем, что при использовании описанной методики на агаризованную среду высевают не только одиночные клетки, но и мелкие кластеры. Деление клеток кластеров может сопровождаться выделением в среду кондиционирующих факторов, которые стимулируют деление одиночных клеток.

Химическая природа и механизм действия кондиционирующего фактора пока не выяснены. Установлено, что он термолабилен, содержит низкомолекулярную фракцию и не может быть заменен фитогормонами. Есть основание полагать, что это не одно какое-то вещество, а комплекс веществ, выделяемых клеткой.

Для кондиционирования питательной среды при культивировании одиночных клеток предложено несколько методов. Самый простой из них – добавление в среду для культуры клеток питательной среды от интенсивно растущей клеточной суспензии в фазу экспоненциального роста (после фильтрации через мелкий фильтр). Равех и Галун (Raveh, Galun, 1975) с целью кондиционирования среды использовали «кормящий слой» - агаризованный слой-подложку облученных клеток, утративших способность к делениям, но способных поддерживать рост других клеток.

Мюир с сотрудниками (Muir et al., 1954) предложили метод культуры-«няньки». На поверхность интенсивно растущего каллюса помещают фильтровальную бумагу, на которую наносят суспензию, содержащую преимущественно одиночные клетки. Образовавшиеся на фильтровальной бумаге колонии можно далее перенести на агаризованную питательную среду. Можно поступить проще: на поверхность агаризованной среды, на которой расположено несколько интенсивно растущих каллюсов, высевают суспензию клеток тонким слоем. Как правило, раньше начинают делиться и образовывать колонии клетки, которые располагаются в непосредственной близости от каллюсных культур.

Некоторые исследователи считали, что одиночные клетки в суспензии можно индуцировать к делению, если использовать питательные среды, обогащенные разными витаминами, аминокислотами, сахарами или растительными экстрактами (кокосовым молоком, гидролизатом казеина). Для некоторых культур эти подходы дали неплохие результаты, однако их круг оказался весьма ограниченным. Так, обогащенная питательная среда 8р Као и Михайлюка (Kao, Michаyluk, 1975) давала хорошие результаты при культивировании лишь разведенных суспензий протопластов бобов и сои, однако она не позволяла культивировать единичные протопласты.

M. Кабош (Caboche, 1980) показал, что если мезофильные протопласты табака в течение первых нескольких дней культивировать на питательной среде, содержащей высокие концентрации ауксина, а затем перенести на среду с пониженным его содержанием, то клетки оказывались способны к делениям даже при плотности высева 1-2 клетки/мл.

Другой возможный подход состоит в предельном уменьшении объема питательной среды при культивировании единичных клеток: в результате отношение объема клетки к объему питательной среды получается таким же, как и в обычных культурах при небольшом разведении. Для этого используются специальные приспособления. Джонс (Jones et al.,1960) предложил для культивирования одиночных клеток метод микрокамеры. Микрокамера представляет собой приспособление, которое несложно получить следующим образом. На предметное стекло с помощью парафинового масла на небольшом расстоянии друг от друга наклеивают два покровных стекла, между ними наносят квадрат из парафинового масла и в него помещают каплю кондиционированной питательной среды с изолированной клеткой. Сверху кладут покровное стекло, которое двумя краями опирается на покровные стекла. В результате под этим стеклом остается полость, в которой проходит культивирование клетки (Рис. 3.4). Подсыхание питательной среды не происходит, так как камера изолирована от окружающей среды парафиновым маслом, при этом возможен воздухобмен. За делением клетки можно наблюдать под микроскопом. Когда колония станет достаточно большой, ее переносят на свежую питательную среду (жидкую или агаризованную). Используя описанную выше методику, Вэзил и Хильдебрандт (Vasil, Hildebrandt, 1965) смогли получить не только колонию от единичной клетки, но и регенерировали из каллюса нормальное цветущее растение табака. При этом в отличие от Джонса, они использовали свежую питательную среду, обогащенную пантотенатом кальция и кокосовым молоком.

Ю.Ю. Глеба (1978) разработал метод культивирования протопластов в микрокаплях питательной среды объемом до 1 мкл. В микрокаплях такого объема, если в них находится лишь одна клетка, отношение объема клетки к объему питательной среды такое же как в макрокультуре с плотностью 10³ клеток/мл. Этот метод нашел широкое применение для механической изоляции с помощью микроманипулятора единичных слившихся протопластов, последующего их клонирования и регенерации растений соматических гибридов.

Опыты по получению растений-регенерантов при культивировании единичных соматических клеток растений предоставили прямое доказательство гипотезы Г. Габерландта о тотипотентности растительной клетки.