Флуоресцентная in situ гибридизация, ДНК пробы: центромерные, локусспецефичные, теломерные, пейнтинговые. Многоцветная FISH.

Среди наиболее распротраненных мутаций у человека являются хромосомые. Показано, что хромосомная патология составляет 30% от общего числа пороков развития у новорожденных, до 45-70% всех случаев спонтанных абортусов (до 15-ой недели беременности) и 6-7% мертворожденных детей этиологически связаны с хромосомными аномалиями. Среди недоношенных детей частота хромосомных аномалий достигает 7:1000. Причем, среди недоношенных детей с врожденными пороками развития уровень хромосомных аномалий достигает 18%, а при наличии комплексных врожденных пороков — более 45%. В среднем аномалии кариотипа встречаются у 15% детей с недифференцированными формами умственной отсталости, врожденными пороками и/или микроаномалиями развития. Поэтому, неудивительно, что особое место в медицинской генетике занимают методы их выявления.

В практической медицине диагностика хромосомных аномалий проводится с использованием цитогенетических методов, которые включают в себя культивирование клеток с целью получения метафазных хромосом с последующим применением дифференциального окрашивания хромосом по длине и исследованием кариотипа с помощью светового микроскопа. Данный комплекс приемов получил широкое распространение в связи с тем, что в течение долгих лет он представлял собой практически единственный способ идентификации хромосомных аномалий. Существует несколько типов дифференциального окрашивания хромосом по длине. Они определяют единую линейную дифференциацию структуры хромосом в метафазе митоза, при этом каждый метод окрашивания имеет свои характерные особенности, и существует в нескольких модификациях. Следует отметить, что они не являются альтернативными. Наиболее распространенным методом дифференциального окрашивания хромосом является G-окрашивание. Он базируется на предварительной обработке препаратов хромосом перед окраской и на использовании нефлюоресцентных красителей или их смесей. Предварительная обработка связана с инкубацией в солевых растворах и в растворах протеолитических ферментов (взаимодействующих, по-видимому, с белковой компонентой хроматина). Идентификацию хромосом обеспечивает чередование темно и светло окрашенных полос. По числу, величине и расположению полос (сегментов) можно определить изменения в хромосомном наборе (кариотипе). Число полос на гаплоидный кариотип при G-окрашивании варьирует, но в метафазной клетке их число не менее 320, а на стадии прометафазы может достигать и 1250. Существуют также и методы, которые окрашивают специфические участки хромосом (например, С-окрашивание, с помощью которого анализируются гетерохроматиновые участки). Применение последних также необходимо при идентификации хромосомных аномалий или дифференциации между хромосомными мутациями и морфологическими особенностями хромосом. Однако в ряде случаев применение цитогенетического анализа метафазных хромосом бывает затруднено или невозможно (сложность культивирования клеток большинства соматических тканей человека; диагностика хромосомных микроаберраций).

С развитием медицинской генетики и совершенствованием микроскопической техники был разработан целый ряд новых технологий, основанных на принципах гибридизации нуклеиновых кислот, применение которых позволило в значительной степени увеличить эффективность выявления хромосомных аномалий, а в ряде случаев даже заменить цитогенетический анализ определенным молекулярно-цитогенетическим. Биомедицинское направление, целью которого явилось изучения хромосом с помощью последних достижений в области молекулярной биологии, сформировалось как наука и получило название молекулярная цитогенетика.

Среди самых распространенных молекулярно-цитогенетических методов известны: флюоресцентная гибридизация in situ (fluorescence in situ hybridization — FISH) и сравнительная геномная гибридизация (comparative genomic hybridization — CGH). Как несложно заметить, оба эти метода основаны на процессе гибридизации нуклеиновых кислот. Гибридизация in situ основана на взаимодействии однонитевых последовательностей экзогенной ДНК, меченной флюорохромами (флюоресцирующими веществами) — ДНК пробы, и исследуемой ДНК. Разрешающая способность молекулярно-цитогенетических методов определяется минимальным размером последовательности хромосомной ДНК (количеством нуклеотидов), которую возможно регистрировать с помощью микроскопа или другой системы детекции. В качестве стандарта при молекулярно-цитогенетическом анализе используются цитогенетические методы.

Первой стадией FISH является денатурация — процесс получения однонитевых последовательностей ДНК. Следующей стадией является гибридизация — реакция воссоединения однонитевых последовательностей ДНК зонда и ДНК, находящейся на цитологическом препарате в составе метафазных хромосом и интерфазных ядер, с образованием двунитевых молекул ДНК. В результате появляется возможность анализа флюоресцирующих последовательностей ДНК на предметном стекле с помощью флюоресцентного микроскопа. Идентичный принцип лежит также в основе метода CGH. Отличие заключается в том, что в случае CGH гибридизация на хромосомах in situ проводится с использованием смеси меченных одним флюорохромом геномной ДНК пациента и другим флюорохромом ДНК донора (при исследовании численных хромосомных аномалий) или геномной ДНК пациента и ДНК какой-то конкретной хромосомы донора (при исследовании структурных хромосомных аномалий). Затем с помощью цифрового анализа производится сравнительная оценка интенсивности суперпозиции сигналов двух разных флюорохромов, в результате чего становится возможным определение приобретения или потери последовательностей ДНК у пациента в строго определенных хромосомах.

В настоящее время известен целый комплекс модификаций FISH. Практически все разновидности метода FISH являются взаимодополняющими при диагностике хромосомных аномалий, поскольку существует достаточно большое количество флюорхромов с различными свойствами. Имеется возможность детекции множества последовательностей ДНК на цитологическом препарате за счет того, что каждая из ДНК проб будет мечена определенным цветом (многоцветовая FISH или MFISH). Тем не менее, одноцветовая FISH является одним из основных среди всех молекулярно-цитогенетических методов. Спектр применения данного метода в значительной степени широк: от диагностики самых распространенных численных хромосомных аномалий (например, синдром Дауна и его мозаичные формы) до идентификации редких структурных хромосомных перестроек при недифференцированных формах наследственной патологии. Особого внимания заслуживает одноцветовая FISH с использованием ДНК проб, маркирующих полностью пару гомологичных хромосом. Этот метод применяется преимущественно для идентификации сложных хромосомных перестроек, реже, он используется для определения численных хромосомных аномалий.

MFISH основывается на создании смеси ДНК проб, меченных различными флюорохромами, которые одновременно вводятся в исследуемый препарат с последующей совместной гибридизацией. Изначально данный метод разрабатывался для идентификации хромосомных аномалий при отсутствии клинического диагноза из-за значительной экономии затрачиваемого экспериментального времени на анализ. Помимо этого, данный метод является эффективным для определения структурных хромосомных аномалий за счет одновременной визуализации нескольких участков хромосом. На базе ранних разработок MFISH были созданы такие высокоразрешающие методы идентификации хромосомных аномалий, как 24-х цветовая FISH и спектральное кариотипирование (SKY — spectral karyotyping). Данные методы используют комбинацию из 24-х ДНК проб, меченных разными флюорохромами, которые соответствуют каждой гомологичной хромосоме. Различие их заключается в том, что для SKY используются специальные спектральные системы детекции, а для 24-х цветовой FISH применяется цифровой анализ изображения, целью которого является создание соответствующей комбинации цветов, в результате чего каждая гомологичная хромосома имеет свою характерную окраску. Использование технологий, основанных на микроманипуляции микроскопическими объектами, позволило создать коллекцию ДНК проб, маркирующих одновременно участки хромосом, соответствующие полосам G-окрашивания. Подобные коллекции обычно состоят из нескольких сот проб и их применение позволяет получить разноцветное сегментное окрашивание всех хромосом с высоким разрешением. MCB FISH (multicolor banding FISH) представляет собой высокоэффективный метод диагностики сложных структурных хромосомных перестроек и микроаберраций.

В настоящее время существует целый ряд модификаций CGH, применение которых рассматривается в качестве оправданных при ряде диагностических процедур. Классический CGH анализ был внедрен в молекулярно-цитогенетическую диагностику для анализа хромосомного набора в клетках тканей, культивирование которых затруднено или невозможно. Среди основных ограничений CGH необходимо отметить невозможность диагностики хромосомного мозаицизма и сбалансированных структурных хромосомных перестроек. Разработка модификаций метода CGH была направлена на создание протоколов для высокоразрешающей идентификации хромосомных микроаберраций (микроделеций и микродупликаций). В результате этого были созданы методы серийного CGH анализа (серийная CGH). Серийный CGH анализ основан не на гибридизации тотальной геномной ДНК донора и пациента, а на применении в качестве ДНК донора специфических последовательностей ДНК, соответствующих определенным участкам хромосом. CGH проводится несколькими сериями с использованием цифровых систем детекции и анализа сравнительной интенсивности сигналов. Методы, основанные на серийной CGH, позволяют проводить идентификацию хромосомных микроаберраций, а также генных мутаций, затрагивающих последовательности ДНК, размер которых больше 50 пар нуклеотидов.

Одним из наиболее используемых методов молекулярно-цитогенетической диагностики является FISH на препаратах культивированных клеток. Данный метод нашел широкое применение в идентификации хромосомных аномалий при различных заболеваниях, многие из которых сопровождаются нарушением психики. Среди преимуществ данного метода следует отметить высокую эффективность определения регулярных и мозаичных форм фактически любой хромосомной патологии. Дополнительным преимуществом этого метода является возможность проведения анализа непосредственно на предметном стекле, которое можно было использовать при классическом цитогенетическом анализе (культивирование клеток исследуемой ткани, дифференциальное окрашивание хромосом, исследование кариотипа с помощью светового микроскопа). Однако невозможность культивирования большинства клеток тканей человека ограничивает FISH анализ на метафазных хромосомах. В результате чего разработан метод FISH на интерфазных ядрах или интерфазная FISH (Рис.6.2.). Этот метод также в значительной степени более эффективен по сравнению с FISH анализом метафазных хромосом при идентификации мозаичных форм численных хромосомных аномалий, поскольку позволяет легко изучить большое количество клеток (до нескольких десятков тысяч). Недостатком этого метода является сложность в определении структурных хромосомных аномалий.

Как уже отмечалось, одним из основных направлений развития методологических подходов к разработке новых вариантов FISH является создание ДНК проб с различными свойствами, связанными с их молекулярным составом и локализацией на хромосомах. Среди ДНК проб для метода FISH можно выделить следующие: ДНК пробы, состоящие из высокоповторяющихся последовательностей ДНК; ДНК пробы, состоящие из уникальных последовательностей ДНК генов; WCP ДНК пробы (whole chromosome probe - проба, маркирующая хромосому полностью) и 24-х цветовая FISH/SKY (набор из 24-х WCP ДНК проб); ДНК пробы, состоящие из участков хромосом (MCB FISH) для MFISH. Наиболее частая процедура в клинической практике — FISH с использованием ДНК проб, состоящих из высокоповторяющихся последовательностей ДНК, для идентификации численных хромосомных аномалий. FISH с применением ДНК проб, состоящих из уникальных последовательностей ДНК, является методом идентификации и локализации структурных хромосомных аномалий и определения изменения ДНК на субхромосомном уровне (выявление точек разрыва). FISH с использованием WCP ДНК проб и 24-х цветовая FISH/SKY (набор из 24-х WCP ДНК проб) являются дополнительными методами диагностики структурных хромосомных аномалий. Эти методы, в основном, используются для уточнения диагноза при наличии перестройки с участием нескольких хромосом. Они также могут быть использованы при диагностике транслокаций с участием небольших участков хромосом. MCB FISH является высокоэффективным методом идентификации сложных структурных хромосомных перестроек и хромосомных микроаберраций.

CGH анализ нашел своё применение в области онкоцитогенетики и диагностики хромосомных микроаберраций у детей с умственной отсталостью. Помимо этого, серийный CGH анализ позволяет с высокой эффективностью определить потерю или приобретение последовательности хромосомной ДНК размером менее одного миллиона пар нуклеотидов.

Необходимо знать, что при постнатальной диагностике хромосомных аномалий молекулярно-цитогенетические методы являются дополнительными к классическим цитогенетическим. Инициирующей стадией диагностики хромосомных аномалий обычно является классический цитогенетический анализ, включающий в себя культивирование исследуемых клеток с целью получения метафазных пластинок, с последующим применением методов дифференциального окрашивания хромосом по длине и исследованием кариотипа с помощью светового микроскопа. Данный метод позволяет идентифицировать или предположить наличие хромосомной аномалии. При необходимости, исходя из предположения, применяется молекулярно-цитогенетическая диагностика. При этом выбирается участок хромосомы, последовательности ДНК которого маркирует соответствующая проба. После этого проводится молекулярно-цитогенетический анализ. Следует отметить и то, что сложные хромосомные перестройки требуют применения нескольких модификаций FISH.

Особого внимания заслуживает молекулярно-цитогенетическая диагностика субтеломерных хромосомных микроаберраций. Частота данных хромосомных аномалий может достигать 5-25% в группах детей с недифференцированными формами умственной отсталости и нарушением психики. До создания коллекций ДНК проб, маркирующих соответствующие участки хромосом, диагностика этой патологии оставалась невозможной. Получение набора ДНК проб, маркирующих все субтеломерные участки хромосом, позволило с высокой эффективностью обнаружить данную форму хромосомной патологии. Другой возможностью идентификации хромосомных микроаберраций является применение различных вариантов метода CGH. Многие исследователи отмечают, что метод серийной CGH является в значительной степени эффективным для диагностики субтеломерных хромосомных микроаберраций. Альтернативным методом диагностики субтеломерных хромосомных микроаберраций, предложенным отечественными исследователями, является использование FISH и ДНК зондов, маркирующих субтеломерные участки хромосом. В настоящее время известны многие клинические характеристики пациентов с субтеломерными микроаберрациями различных хромосом. Благодаря этому, становится возможным теоретически выделить ту хромосому, в которой с наибольшей вероятностью расположена микроаберрация, в результате исчезает необходимость одновременного использования нескольких зондов и анализ производится с использованием лишь одной субтеломерной ДНК пробы.

Синдром Марфана

(Болезнь Марфана, Marfan syndrome, арахнодактилия) — заболевание из группы наследственных коллагенопатий, заболеваний соединительной ткани человека. Наследственное заболевание, наследуется по аутосомно-доминантому типу. входит под номером 154700 в систему табуляции МакКьюсика OMIM. Заболевание имеет полиорганные проявления. Помимо характерных изменений в органах опорно-двигательного аппарата (удлинённые кости скелета, гиперподвижность суставов), наблюдается патология в органах зрения и сердечно-сосудистой системы, что составляет классическую триаду.

История

Признаки заболевания в органах опорно-двигательного аппарата впервые описаны французским педиатром А.Марфаном в 1896 году. Характерный внешний габитус подобных пациентов с тех пор стали именовать синдромом Марфана. Salle в 1912 году отметил сочетание глазных и сердечных аномалий со скелетными.

Позднее выяснилось, что в действительности девочка страдала врожденной контрактурной арахнодактилией.

Позже были описаны первые фенокопии марфаноподобных синдромов, в частности, синдром эктопии хрусталиков с аутосомно-доминантным наследованием, синдром дилатации и расслоения аорты, пролапс митрального клапана, эктазии твердой мозговой оболочки.

Американский генетик МакКьюсик (McKusick) открыл этим синдромом новую нозологическую страницу наследственных заболеваний соединительной ткани.

Фенотип больных характеризуется определённой протяженностью: начиная от легких, «мягких» форм соединительнотканой дисплазии, встречающихся и в общей популяции — до случаев с угрожающими жизни системными расстройствами.

Синдром Марфана (арахнодактилия; акромакрия, долихостеномелия; врожденная мезодермальная дистрофия, Денни-Марфана синдром; MIM 154700 ) характеризуется арахнодактилией в сочетании с различными глазными, скелетными и висцеральными дефектами ( Robinson P.N.,2000 ).

Характерными признаками болезни Марфана являются изменения со стороны следующих систем: костно-суставная система - долихоцефалия, готическое небо, прогнатизм, кифоз, иногда со сколиозом и сращением поясничных позвонков, воронкообразная или килевидная грудная клетка, удлинение конечностей, арахнодактилия, разболтанность суставов, плоскостопие. Сердечно-сосудистая система поражется в 40-60 процентах случае: выявляются аневризмы аорты и другие аномалии артерий, дефекты клапанов и перегородки сердца. Смешанные дефекты мягких тканей: атрофические борозды, скудный подкожножировой слой, грыжи, слабость связок и сухожилий. Нередки дефекты легких и эктопии почек. Большинство больныз имеют патологию со сторны глаз: эктопия хрусталика, миопия, косоглазие, нередко катаракта и колобома радужной оболочки.