Седиментация макромолекул. Ультрацентрифугирование.

Одним из наиболее точных и широко используемых методов для определения параметров макромолекул является метод седиментации (центрифугирования). Седиментация – это осаждение частиц в жидкости под действием силы тяжести.

Седиментация макромолекул в обычных условиях невозможна, т.к. тепловая энергия молекул значительно выше энергии гравитации. Энергия гравитации макромолекулы с м.м. 10⁵ составляет Е_гр = mgh = 1,6 • 10^-23 Дж. Величина Е_Q тепловой энергии составит

Е_Q = K₀T = 1,38 • 10^-23• 293 K = 4 • 10^-21 Дж.

Как видно, тепловая энергия таких молекул почти в 200 раз больше гравитационной энергии. Таким образом, для макромолекул сила гравитации настолько мала, что действие случайных соударений с молекулами растворителя значительно превышает седиментацию макромолекул.

Осадить макромолекулу молекулы можно, увеличив потенциальную энергию до величин, превышающих K₀T. Это можно сделать в специальных приборах - ультрацентрифугах. В них, за счет больших центробежных ускорений, превышающих g в 10⁴–10⁵ раз, создаются центробежные силы, в результате которых происходит седиментация макромолекул. При ультрацентрифугировании частицы движутся под действием центробежной силы и через определенный промежуток времени распределяются по длине центрифужной пробирки. Измерение движения молекул вдоль направления действия центробежной силы называется определением скорости седиментации. Определяемым параметром в этом случае является коэффициент седиментации, который дает информацию о массе и форме макромолекулы. Современные ультрацентрифуги работают при больших ускорениях (до 450000g) с контролем температуры в пределах 0,1 °С. Для создания таких больших ускорений, необходимы ультрацентрифуги, со скоростью вращения ротора до 80000 оборотов в минуту. Число g при центрифугировании указывает, во сколько раз угловое ускорение вращающегося ротора, превышает ускорение земного притяжения. Значение g зависит от скорости вращения и радиуса ротора.

Основными частями ультрацентрифуги являются электрический двигатель, ротор помещенный в защитную камеру, охлаждающее устройство, вакуумный насос (Рис. 9). Центрифужные роторы бывают двух типов: угловые и подвесными стаканами. Центрифуги используется преимущественно для фракционирования и очистки макромолекул, компонентов клетки (препаративное центрифугирование) и для определения массы макромолекул и макромолекулярных комплексов (аналитическое центрифугирование).

Рассмотрим метод определения массы макромолекулы путем измерения скорости седиментации.

Если частица раствора находится в поле центробежной силы, образующейся при вращении ротора с угловой скоростью w, на нее действует центробежная силаF_ц:

F_ц = m w²r,

гдеm - масса частицы,r -расстояние до центра вращения.

Рис.9. Устройство препаративной ультрацентрифуги (Фрайфельдер,281 с).

1- ротор; 2 – охлаждающая камера; 3- двигатель; 4 – панель управления; 5 – вакуумный насос; 6 – компрессор.

Молекулы растворителя будут вытесняться при движении частицы, и их сопротивление вызывает выталкивающую силу F_в = m₀w²r, направленную против центробежной силы (m₀ =масса вытолкнутой жидкости). Осаждению частицы будет препятствовать и сила трения частицы о молекулы растворителя F_с = fv, где f – коэффициент трения;v = скорость осаждения частицы относительно стенок центрифужного стакана.

Через определенное время после начала вращения ротора силы, действующие на осаждающуюся частицу, уравновешиваются, и она двигается с постоянной скоростью v.

F_ц = F_в + F_с

Скорость осаждения частицы можно рассчитать по формуле:

v = m w²r (1 – Vρ)/ f,

где V –парциальный объем частицы, V = 1/ρ (л/кг). Эта величинаопределяется как возрастание объема растворителя при растворении 1 кг сухого вещества в фиксированном объеме растворителя; ρ –плотность растворителя.

Из этой формулы следует что, при центрифугировании соблюдаются следующие закономерности:

1. Тяжелая частица осаждается быстрее, чем менее тяжелая

2. Более плотная частица также осаждается быстрее, чем менее плотная

3. Чем больше плотность растворителя, тем медленней будет скорость осаждения.

4. Чем больше коэффициент трения тем медленнее движется частица .

Эти четыре положения универсальны и выполняются при осаждении любых частиц, в т.ч. макромолекул. Поскольку скорость осаждения молекул пропорциональна величине центробежной силыm w²r,то седиментационные свойства частицы зависят от скорости осаждения и выражаются через коэффициент седиментации S:

S = v/ w²r

Коэффициента седиментации измеряется в секундах – [с].За единицу коэффициента седиментации принят 1 сведберг (С) –10^-13 с..

где V – парциальный объем ( увеличение объема при прибавлении к раствору определенного количества вещества) ; ρ – плотность растворителя; D – коэффициент диффузии.

Для определения молекулярной массы необходимо измерить на центрифуге величину S, определить значениеD и знать V. Требуется высокая точность измерения V, так как для биологических макромолекул он изменяется в небольших пределах (от 0,6 до 0,75). Ошибка при его измерении в 1 % дает ошибку в определении молекулярной массы до 3 %.

Для определения молекулярной массы по формуле Сведберга, необходимо измерить S и D в одинаковых растворителях, при одинаковых температурах, экстраполируя полученные значения к бесконечному разбавлению, , S⁰ .

В таблице 6 приведены значения , S⁰ s для некоторых молекул белков и полученные по ним молекулярные массы. Иногда массу субмолекулярных частиц и макромолекул выражают в единицах Сведберга, например, 16S –РНК, 80S-рибосома.