Постановка реакции.

1. Исследуемый материал наносят на предметное стекло и фиксируют (чаще всего в ацетоне, 10 мин, при комн. t0), высушивают 20 мин, 370С.

2. На фиксированный мазок наносят люминесцентную сыворотку, содержащую специфические антитела, меченные изотиоцианатом, 30 мин, 250С (во влажной камере).

3. Промывка буферным раствором, 10 мин, 250С.

4. Люминесцентная микроскопия: сначала при 40х, а затем – 90х (обращают внимание не только на наличие свечения, но и его интенсивность, характер распределения).

Учет реакции. «+» реакция –клеткисветятся (видимый эффект) по периферии в виде каймы желто-зеленого цвета в люминесцентном микроскопе.

Недостаткомпрямого метода является необходимость приготовления широкого набора флюоресцирующих антисывороток против каждого изучаемого антигена.

Непрямая РИФпроводитсяс использованием двух различных антисывороток. Вначале применяют немеченые АТ против искомого антигена, а затем образовавшиеся комплексы АГ-АТ обрабатывают люминесцирующей антисывороткой, содержащей меченые антитела против гамма-глобулинов того вида животного, которого иммунизировали при получении немеченой сыворотки (например, антиглобулиновая кроличья сыворотка, содержащая антитела к глобулинам кролика).

Если немеченая антисыворотка была получена путем иммунизации кроликов, то на втором этапе используют меченую антивидовую кроличью сыворотку, полученную путем иммунизации кроличьими гамма-глобулинами ослов или каких-либо других животных.

Таким образом, необходимо иметь только антивидовую флюоресцирующую сыворотку.

При постановке непрямой РИФ:

1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой 30 мин, 250С и промывка 10 мин, 250С – образуется несветящийся комплекс АГ-АТ (антитела покрывают антиген первым слоем);

2) обработка антивидовой меченной сывороткой 30 мин, 250С, промывка 10 мин, 250С – антиглобулиновые меченные антитела связываются со специфическими антителами, которые служат для них антигенами (меченные АТ покрывают искомый АГ вторым слоем: АГ-АТ-АТ+флюорохром), вызывая свечение при люминесцентной микроскопии (т.е. АГ становится видимым в люминесцентном микроскопе).

Антикомплементарная РИФпредполагает применение меченых АТ против комплемента морской свинки. Для реакции используется комплемент, который фиксируется на комплексе антиген-антитело. Добавление к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки позволяет увидеть АГ по специфическому свечению в люминесцентном микроскопе.

При постановке РИФ с комплементом:

1) обработка препарата немеченой специфической антисывороткой и комлементом морской свинки 30 мин, 250С и промывка 10 мин, 250С – образуется несветящийся иммунный комплекс (АГ-АТ), на котором адсорбируется комплемент (АГ-АТ-комплемент);

2) обработка антикомплементарной меченной сывороткой (содержит антитела против глобулинов морской свинки) 30 мин, 250С, промывка 10 мин, 250С - комплекс АГ-АТ-комплемент взаимодействует с флюоресцирующим антителом к комплементу и полученный многокомпонентный комплекс (АГ-АТ-комплемент-АТ+флюорохром) светится в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Необходимо иметь только одну флюоресцирующую сыворотку – антикомплементарную.

Достоинствомнепрямой и антикомплементарной РИФ является использование лишь одной светящейся сыворотки (антивидовой или антикомплементарной) при обнаружении различных антигенов.Это значительно удешевляет реакцию. Но с другой стороны по мере усложнения процедуры РИФ возрастает и возможность ошибок. РИФ нельзя отнести и к числу высокочувствительных реакций. Не исключается возможность неспецифической адсорбции меченых АТ на препарате.

Для исключения ложноположительных результатов реакцию сопровождают рядом контролей (контроль с гетерологичным антигеном, контроль с неинфицированной культурой и т.д.). Применение лантаноидной метки (металлы лантаноидной группы) существенно повышает чувствительность метода.

Непрямой вариант РИФ можно использовать и для определения АТ в сыворотке больного. Для этого известный антиген (культура клеток, срезы тканей) наносят на предметное стекло и инкубируют в присутствии исследуемой сыворотки, а затем - в присутствии меченых флюорохромом антител к иммуноглобулинам человека (антисыворотка к глобулинам человека). Этот метод используют для выявления антинуклеарных антител при аутоиммунных заболеваниях и антител к некоторым вирусам.






Дата добавления: 2017-01-08; просмотров: 1187;


Поиск по сайту:

Воспользовавшись поиском можно найти нужную информацию на сайте.

Поделитесь с друзьями:

Считаете данную информацию полезной, тогда расскажите друзьям в соц. сетях.
Poznayka.org - Познайка.Орг - 2016-2020 год. Материал предоставляется для ознакомительных и учебных целей. | Обратная связь
Генерация страницы за: 0.007 сек.