Воздействие продуктов трансгенов на организмы-немишени

Одним из наиболее значимых неблагоприятных эффектов ГМО считается отрицательное влияние продуктов трансгенов на организмы, не являющиеся мишенью трансгенного признака. Организмами-немишенями называют все организмы, на которые непосредственно не нацелено воздействие трансгенного организма, связанное с генно-инженерной модификацией. Возникновение эффекта в первую очередь может быть вызвано использованием растений, обладающих пестицидными свойствами в результате генно-инженерных модификаций, вызывающих у них синтез, например, Bt-протеинов. В настоящее время ведутся работы по расширению спектра эндотоксинов, которые можно привнести в сельскохозяйственные растения с помощью генно-инженерных модификаций, однако Bt-протеины по ряду причин пока что остаются вне конкуренции.

С точки зрения биобезопасности наиболее важной из этих причин является высокая токсичность Bt-протеинов и специфичность (целенаправленность) действия в отношении определенных групп насекомых-вредителей. Эндотоксин, кодируемый определенным геном cry, имеет поражающее действие на определенную систематическую группу насекомых, например, только на представителей чешуекрылых (Lepidoptera) или на представителей только жесткокрылых (Coleoptera) (таб.3.3). При этом Bt-протеины абсолютно безвредны для человека и теплокровных животных.

Несмотря на высокую специфичность действия Bt-протеинов невозможно полностью исключить вероятность их неблагоприятного воздействия на непаразитарных представителей из тех же семейств, что и насекомые-мишени. Например, к семейству Lepidoptera наряду с серьезными вредителями сельскохозяйственных культур, такими как капустная моль (Plutella xylostella), кукурузный мотылек (Ostrinia nubilalis), яблонная плодожорка (Cydia pomonella), коробочный хлопковый червь (Helicoverpa armigera) и другие, принадлежат насекомые, не представляющие угрозу сельскохозяйственным культурам (большинство бабочек), а также для насекомых, являющихся полезными в качестве опылителей или напрямую используемых человеком (шелковичные черви Antnaea perngicuerin [Antheraea pernyi] и Bombyx mori). Такие нейтральные или полезные насекомые не всегда потребляют Bt-протеин с кормом, однако могут подвергнуться его действию при попадании эндотоксина на их кормовую базу.

Побочное нежелательное действие Bt-токсинов на организмы-немишени известно в связи с использованием распыляемых бактериальных препаратов на основе Bacillus thuringiensis. Возможно также попадание Bt и других токсинов трансгенного происхождения на кормовую базу нейтральных и полезных насекомых и других беспозвоночных животных. Во-первых, в случае если ген токсичности экспрессируется в пыльце, то токсин может распространяться с пыльцой сельскохозяйственных ГМ-растений. Во-вторых, возможно попадание Bt-протеинов в почву с остатками трансгенных растений или выделениями их корней. В данном случае могут пострадать беспозвоночные животные почвы и ризосферы растений, обеспечивающие минерализацию почвы и ее плодородие. Например, возможно негативное действие Bt-токсинов на земляных червей и ногохвосток. Несмотря на довольно быстрое разложение Bt-протеинов в почве (период полураспада от 2 до 10 дней в зависимости от почвенных условий, они, подобно ДНК, могут довольно долго сохранять активность в связанном состоянии при образовании конгломерата с глиной или гуминовыми кислотами. Так, в почвах, содержащих каолин, Bt-протеины сохраняли уровень токсичности, достаточный для уничтожения рогатой гусеницы табака (Manduca sexta) в течение шести месяцев. Этот период еще увеличивался при повышении кислотности почв.

Кроме прямого ненаправленного действия токсина, связанного с его непосредственным потреблением полезными и нейтральными животными, возможно опосредованное нежелательное действие токсина через взаимоотношения хищничества или паразитарности. Опасения, касающиеся возможности такого негативного воздействия токсинов трансгенных растений на популяции полезных насекомых, питающихся насекомыми-мишенями трансгенного признака, например, популяции златоглазки (Chrysoperla carnea) и божьей коровки (Hippodamia convergent), неоднократно высказывались научной общественностью.

Беспокойства по поводу нецелевого ущерба, наносимого Bt-токсинами, основаны, как правило, на данных лабораторных тестов, далеких от реальных условий существования и поведения насекомых. Например, хищным насекомым (Chrysoperla carnea) не предоставляют возможности в выборе жертвы и тем самым искусственно вынуждают их питаться вредителями, которыми в природе они не только не питаются, но и с которыми они редко сталкиваются, как это случилось при искусственном скармливании личинок кукурузного мотылька златоглазке [Hilbeck et al.,1998]. Или непреднамеренно искусственно завышают концентрацию токсина, которую реально может потребить насекомое, путем нанесения избыточного количества неочищенной от растительных остатков пыльцы на листья, скармливаемые растительноядным насекомым, как это случилось в опыте, проведенном J.E. Losey с соавторами (1999) по скармливанию гусеницам бабочки-данаиды (Монарх) (Danаus plexippus) листьев ваточника с искусственно нанесенной пыльцой трансгенной кукурузы Bt11. Несмотря на относительность результатов и слабое соотношение моделируемых в лабораторном тесте условий с реальными событиями, происходящими в природе, такой тест является основой для выявления наличия фактора риска, связанного с токсичностью и другими нецелевыми воздействиями продукта трансгена, или полного исключения вероятности его возникновения.

Уменьшению нецелевого пестицидного действия трансгенных растений может способствовать использование специальных промоторов, позволяющих генам токсичности экспрессироваться только в частях растений, повреждаемых вредителями и не экспрессироваться в пыльце; а также встраивание генов токсинов, которые быстро разрушаются в почве.

В последнее время в связи с развитием направления генетической инженерии, связанного с приданием растениям функций биореакторов (синтез растениями вакцин, алкалоидов, витаминов, гормонов и других физиологически активных и фармацевтических веществ) спектр организмов-немишеней может расшириться за счет теплокровных животных, случайно потребивших такие растения. Опасность нецелевого действия трансгена возрастает, если он попадает в результате миграции в популяции свободноживущих растений за пределы охраняемых от нежелательного посещения животными территорий или при переопылении других сортов не биофармацевтического назначения этой же сельскохозяйственной культуры, что превращает в организмы-немишени человека и сельскохозяйственных животных. Неслучайно к посадкам таких растений предъявляются особые требования по изоляции и предотвращению возможности переопыления с посадками растений пищевого или кормового назначения.

Еще одно нецелевое воздействие на организмы-немишени может быть связано с использованием ГМ-бактерий ризосферы растений (бактерии группы Rhizobia), а также трансгенных микориз, работы по созданию которых ведутся в настоящее время. Неблагоприятное воздействие на окружающую среду может быть следствием смены азотфиксирующими бактериями или полезными микоризами первоначального хозяина-носителя на нового симбионта. Такая смена хозяина может вызвать резкое усиление конкурентных возможностей нового носителя-симбионта, которое может негативно сказаться на сложившихся взаимоотношениях внутри биоценоза. Потеря симбионтной бактерии или микоризы, в свою очередь, может стать причиной угнетения организма-мишени действия ГММ.

К сожалению, большинство исследований воздействий, производимых природными микоризами и природными или ГМ-Rhizobia, касаются только конкретного растения-хозяина и не предусматривают изучение изменений в растительных сообществах и сообществах ризосферы растений при смене хозяина, поэтому научные данные по этому вопросу практически отсутствуют. Можно предположить незначительность действия этого фактора в природных, и особенно в лесных, сообществах, где такой нецелевой эффект может проявить себя скорее всего. Природные сообщества, изначально разнообразны по своему видовому составу и весьма стабильны, что может послужить защитным фактором от неожиданного и быстрого изменения в почвенных и растительных сообществах. Однако интерес, который биотехнологии проявляют в отношении трансгенеза микориз, требует более внимательного отношения к изучению проблем экологических взаимоотношений с участием эндо- и эктомикориз и бактерий ризосферы.

3.7.2. Оценка действия продуктов трансгенов на организмы-немишени

С точки зрения выявления и оценки потенциальных последствий риск, связанный с нецелевым воздействием продукта трансгена, является, пожалуй, одним из наиболее сложных. С одной стороны, может оказаться сложным учесть и выявить всех участников пищевой цепочки, которые могут подвергнуться действию токсина, включая все возможные взаимоотношения хищничества и паразитизма. С другой стороны, множество факторов биотического и абиотического свойства, которые практически невозможно воссоздать в лаборатории и даже в условиях ограниченного полевого эксперимента, могут повлиять на вероятность, интенсивность и специфику проявления токсического эффекта. При проявлении отдаленных эффектов, связанных с участием нескольких посредников между первоначальным действием токсина и конечной непредвиденной мишенью, может пройти несколько лет и генераций организмов, подверженных действию селективного фактора в той или иной степени. Поэтому окончательное суждение о нецелевом действии токсина и его последствиях может быть составлено только после длительного мониторинга за объектом наблюдений или рядом связанных между собой объектов в условиях широкомасштабного эксперимента в различных условиях окружающей среды, отражающих в максимально возможном объеме условия известных мест обитания организмов-немишеней.

Наиболее важная информация, необходимая для оценки нецелевого воздействия ГМО на организмы-немишени, касается описания мест естественного произрастания организма-реципиента трансгенного признака, его потенциально значимых взаимодействий с животными или другими организмами типичного для него биоценоза (биологические особенности реципиентного организма). Выявлению возможной токсичности и характера токсичного действия поможет информация о характере генно-инженерной модификации: название донорного организма-источника трансгена, описание регуляторных и других элементов, влияющих на функционирование трансгенов. При описании биологических особенностей ГМО надо учитывать активность и свойства протеина, кодируемого трансгенном, уровень экспрессии трансгена, части растения, в которых трансгены экспрессируются (например, только в зеленых частях растения, или также и в пыльце). При анализе информации о потенциальной принимающей среде и взаимодействии ГМО с окружающей средой наиболее важны сведения, касающиеся идентификации и описания организмов-мишеней и организмов-немишеней, которые могут быть подвержены влиянию ГМО, а также предполагаемого механизма и результата взаимодействия ГМО с организмами-мишенями. При предполагаемом использовании ГМО в качестве биореакторов при оценке сведений, касающихся условий высвобождения ГМО, следует уделить особое внимание мерам, предохраняющим территорию посадок ГМО от нежелательного посещения ее животными.

Стройная система оценки нецелевого действия факторов, вызванных действием трансгена, разработана в США Агентством по защите окружающей среды (US EPA). Она представлена трехступенчатой схемой (Рис. 3.5). На первом этапе устанавливаютналичие фактора риска, т.е.токсичности (происхождение токсина, характер его действия) и уровень токсичности, который может привести к возникновению неблагоприятных последствий (особенности экспрессии гена), а также выявление круга предполагаемых организмов-немишеней. Наличие токсических эффектов определяют на основании лабораторных тестов по скармливанию продукта трансгена, например определенного типа Bt-протеина, кодируемого встроенным геном, ряду организмов, которые могут оказаться в числе организмов-немишеней. Следуя принципу принятия мер предосторожности, в лабораторном остром эксперименте, как правило, используют повышенные дозы предполагаемого токсина, употребляемого в виде очищенного вещества. Если обнаружен поражающий эффект очищенного токсина, проводят лабораторные и полевые тесты с использованием посредника-медиатора действия токсина, например пыльцы, которая может быть его переносчиком, или зараженных токсином личинок или яиц организма-мишени. Определяют летальную дозу токсина (LD₅₀), и дозу, вызывающую ингибирование роста и развития организма (сублетальный эффект ЕС₅₀).

Так как наибольшую сложность вызывает определение круга возможных организмов-немишеней, US EPA предлагает для оценки новых видов токсинов биологического происхождения использовать стандартные наборы организмов. Для Bt-токсинов это птицы (несмотря на отсутствие подтвержденных сведений о Bt-токсичности в отношении теплокровных животных); водные животные (рыбы, обитающие на рисовых плантациях, или способные контактировать с пыльцой и другими частями Bt-растений и Bt-микроорганизмами), водные беспозвоночные, например дафнии (Daphnia)), почвенные животные - черви и ногохвостки (Collembola) иполезные насекомые. Среди тестируемых полезных насекомых должны быть обязательно представлены насекомые-опылители на примере медоносной пчелы (Apis mellifera L.) (тест проводят на личинках и взрослых особях) и еще трех видах насекомых, принадлежащих к различным отрядам, в которых встречаются виды-паразиты или хищники, питающиеся насекомыми-вредителями. Это могут быть представители следующих групп: паразитарные двукрылые и гименовые (например, Brachymeria intermedia – паразит домашней мухи), хищные жесткокрылые (обычно божьи коровки Hippodamia convergent, Adalia bipunctata или Coccinella septempunctata), полужесткокрылые, сетчатокрылые (обычно златоглазки), а также хищные клещи.

На втором этапе выявляютэкологические факторы, в которых действует фактор риска, и которые определяют вероятность возникновения неблагоприятных последствий, связанных с использованием ГМО. Эти факторы касаются биологии и экологии самих ГМО (характеристика фактора стресса), организмов-немишеней (характеристика объекта потенциального риска) и среды их обитания (экологические факторы воздействия, такие как база питания организма-немишени и другие).

На третьем этапе проводят предварительную оценку степени риска с учетом всех экологических условий действия фактора риска и дают окончательную оценку возможности использования ГМО с учетом поражающего эффекта фактора риска, факторов неопределенности и условий предполагаемого регулирования риска.

Одним из примеров наиболее полного и последовательного исследования нецелевого влияния трансгенных сельскохозяйственных растений на организмы-немишени может служить оценка влияния выращивания Bt-кукурузы на численность популяции бабочки Монарх (Donaus plexippus L.), отряд Lepidoptera, проведенное группой ученых из США и Канады. Поводом для исследования стали разногласия, возникшие в среде научной общественности по поводу истинных причин существенного сокращения численности этого вида насекомых, популяции которого населяют регионы так называемого «кукурузного пояса» США, а также южную часть Канады и Мексику.

В 1999 г. появилось сообщение американских энтомологов [Losey et al., 1999] о выявленном токсическом эффекте пыльцы трансгенной кукурузы на рост и развитие гусениц бабочки. Выводы делались на основании данных лабораторного теста на токсичность с использованием ручного напыления пыльцы трансгенной кукурузы Bt11 (ген сry1Ab) на листья одного из видов ваточника, которым в природе питается бабочка. Это сообщение было сразу же взято на вооружение противниками выращивания трансгенных культур. Однако в ответ на эту статью и обвинения в адрес трансгенной кукурузы были высказаны также обоснованные сомнения по поводу правильности постановки самого эксперимента и правильности выводов о негативном влиянии Bt-кукурузы на численность бабочки, сделанные при отсутствии каких-либо данных экологических исследований. В результате US EPA выделило грант на изучение проблемы и создало группу из специалистов-биологов различного профиля для изучения всех аспектов проблемы согласно принципам и методам, применяемым этим учреждением. Схема эксперимента представлена на рис.3.6.

На первом этапе анализа применили методику острого эксперимента по скармливанию гусеницам бабочки искусственного питания с добавлением очищенного кристаллического токсина четырех типов (Cry1Ab, Cry1Ac, Cry9 C и Cry1 F); листьев ваточника (Asclepias spp), опыленных чистой пыльцой ряда гибридов Bt-кукурузы (Bt11, 176 и Mon810, вырабатывающих токсин Cry1Ab; Cbh351 – вырабатывающий токсин Cry9 C и Dbt418- вырабатывающий токсин Cry1 F) и листьев ваточника, опыленных пыльцой, загрязненной остатками вегетативных тканей кукурузы. Учитывали летальный и сублетальный эффекты на разных стадиях развития гусеницы.

В эксперименте с добавлением чистого токсина было показано полное отсутствие неблагоприятных эффектов при использовании токсинов Cry9C и Cry1F. Действительный токсический эффект при скармливании листьев, опыленных чистой пыльцой был выявлен только в случае трансгенной формы 176. Причем эффект проявлялся при малых дозах нанесения пыльцы, сопоставимых с реально возможными при переносе пыльцы с кукурузы на растения ваточника в природе. В других случаях использования Cry1Ab-гена (Bt11 и Mon810) токсический эффект наблюдали только, если пыльца была загрязнена остатками вегетативных тканей растения, чего как правило не бывает при естественном распространении пыльцы. На основании результатов проведенного исследования было сделано заключение о возможном токсическом эффекте для гусениц бабочки в природных условиях только гибридов кукурузы, происходящих от линии 176. К 2001 году этой кукурузой было засеяно менее 2% от площадей, занятых всей трансгенной кукурузой США, и перерегистрация ее для дальнейшего использования не предполагалась.

Эксперимент выявил ряд сложностей, с которыми может быть связана реальная оценка токсичности пыльцы на основе только лабораторного теста, и показал необходимость проведения экологических полевых экспериментов для оценки реальных последствий воздействия пыльцы Bt-кукурузы на развитие гусеницы и численность бабочки.

Полевой эксперимент проводили на различных участках в разных штатах США и Канады, отражающих наиболее типичные места обитания бабочки Монарх в различных климатических зонах. Кроме токсического эффекта изучали плотность оседания пыльцы на растениях ваточника, растущих внутри кукурузных полей и по их краям, влияние климатических факторов (ветер, дождь) на распространение и сохранность пыльцы на листьях, предпочтения гусениц в питании в пределах растения.

Эксперимент подтвердил токсический сублетальный эффект пыльцы гибрида кукурузы, происходившего от линии 176 и отсутствие эффектов для гибридов, бравших начало от кукурузы Bt 11 и Mon 810. В случае гибрида от линии 176 была установлена худшая выживаемость и развитие личинок которые питались на растениях ваточника, растущих внутри кукурузных полей, по сравнению с выживаемостью тех, что кормились за пределами поля. Это объяснялось большей плотностью оседания пыльцы на ваточнике внутри полей. Средняя плотность оседания пыльцы для всех гибридов кукурузы оказалась примерно одинаковой и составляла 127 пыльцевых зерен на 1 см² листа. Токсический эффект для линии 176 был заметен при плотности пыльцы около 67 зерен на 1 см². Как показали лабораторные тесты, для того, чтобы выявить токсичность Bt 11 и Mon810, плотность пыльцы должна превышать 1000 зерен на 1 см² листа, что в природных условиях практически нереально (на 95% листьев ваточника плотность пыльцы не превышала 600 зерен на 1 см²). Количество пыльцы на сорных растениях резко уменьшалось при выпадении дождей. Было показано, что личинки предпочитают кормиться на верхушечных листьях ваточника, тогда как максимальное количество пыльцы наблюдалось на среднем ярусе листьев этих растений. Даже в случае питания гусениц на полях кукурузы линии 176 сублетальный эффект был ниже, чем для гусениц, питавшихся на полях нетрансгенной кукурузы, обработанных химическим инсектицидом λ-цихалотрином. Таким образом, в полевом эксперименте была подтверждена полная безопасность большинства используемых ныне гибридов Cry1Ab Bt-кукурузы. Даже если токсический эффект проявлялся, он был ниже того, который наблюдался при выращивании нетрансгенной кукурузы, обрабатываемой химическими инсектицидами.

На втором этапе полевых исследований изучали экологические условия воздействия стрессового фактора. Были определены численность и плотность популяций бабочки в различных регионах «кукурузного пояса» (штаты Миннесота, Айова, Мэриленд и Висконсин в США и Онтарио – в Канаде), зависимость численности бабочки от количества зарослей ваточника. Определены предпочтения бабочек в откладывании яиц между растениями, растущими внутри и снаружи кукурузных полей, характер распределения популяций ваточника и их численность в разных регионах выращивания кукурузы. Кроме этого была проведена оценка вероятности перекрывания во времени в разных климатических регионах двух важных с точки зрения интенсивности токсического действия кукурузы фенологических событий – периода откладывания яиц и развития гусениц бабочки и максимума пыления кукурузы.

Было выяснено, что бабочка привязана к растениям ваточника, расположенным внутри или вокруг полей кукурузы весь период своего развития. Численность бабочек на одно растение ваточника практически одинаково как в агросреде, так и в неокультуренных (природных) местах произрастания ваточника. В регионах большей плотности кукурузных полей и редко встречающихся природных зон предпочтение бабочками явно отдается агросреде, так как это основные места произрастания ваточника, являющегося кормовой базой бабочек и их личинок. В менее освоенных регионах явного предпочтения не наблюдалось. При обитании в агросреде, бабочки предпочитали растения ваточника, растущие внутри полей, что, очевидно, объяснялось меньшей конкуренцией бабочек с другими видами насекомых и животных.

При изучении перекрывания по времени максимального пыления кукурузы (максимального увеличения плотности пыльцы) и периодов развития бабочки оказалось, что в южных штатах, где бабочка чаще селится внутри кукурузных полей, основная часть особей успевает пройти стадию личинки и развиться до взрослого состояния до начала интенсивного пыления кукурузы. В северных регионах периоды пыления кукурузы и личиночной стадии бабочки совпадали, но именно в этих регионах у бабочек больше возможностей селиться за пределами агросреды. Таким образом, было показано, что основное влияние на численность бабочек оказывает кормовая база, т.е. наличие зарослей ваточника, а оно в свою очередь в наибольшей степени определяется применяемыми в том или ином регионе методами ведения сельскохозяйственного производства (применение вспашки, гербицидов, выбор основной сельскохозяйственной культуры).

В результате проведенных исследований экспертная группа сделала следующие обобщенные выводы:

1) Экспрессия Bt токсинов в пыльце большинства коммерческих гибридов кукурузы очень мала. Поэтому лабораторный и полевой тест показывают отсутствие токсических эффектов при плотности пыльцы, обычной при пылении кукурузы

2) Только часть бабочек использует заросли ваточника внутри и возле кукурузных полей. При этом наблюдается различное и ограниченное перекрывание периода основного пыления кукурузы и активного периода размножения и развития бабочек. Поэтому токсичность пыльцы не может радикальным образом повлиять на численность вида бабочки.

3) С учетом площадей, занимаемых трансгенной Bt-кукурузой, уровня токсичности и экспозиции действия токсина (плотность и время действия пыльцы) риск воздействия трансгенной кукурузы на численность популяции бабочки Монарх можно признать крайне незначительным. По расчетам экспертов при существовавшем в 2000-2001 году уровне использовании гибридов на основе линии 176, риску токсического действия пыльцы этих гибридов могли подвергнуться не более 0.8% популяции бабочки, обитающей в регионе «кукурузного пояса». Это еще раз говорит о незначительности нецелевого действия трансгена (даже если оно присутствует) на численность вида-немишени.

4) Основной причиной сокращения численности бабочки Монарх в США следует признать сокращение ее природного ареала в связи с интенсивным сельскохозяйственным производством и связанным с ним сокращением численности ваточника, на котором бабочка кормится и размножается.