Горизонтальный перенос генов

В природе существуют три способа горизонтального переноса генов: конъюгация, трансдукция и трансформация. Первые два способа характерны для микроорганизмов и могут быть как средством переноса генетического материала между бактериями одного и того же или близких видов, так и средством переноса генетического материала между бактериями, принадлежащими к разным систематическим группам. Трансформация может быть средством переноса генетической информации как между бактериями, так и между систематически весьма отдаленными группами организмов. Например, между бактериями и растениями происходит процесс естественной передачи бактериальной ДНК посредством Ti-плазмиды от почвенных бактерий из рода Agrobacterium двудольным растениям с последующим встраиванием ДНК плазмиды в геном растений. Обратный процесс передачи генетического материала от растений к бактериям в природе до сих пор не зафиксирован, хотя сделан ряд успешных попыток осуществления этого процесса в лабораторных условиях. Косвенным подтверждением возможности переноса некоторых генов от эукариотических к прокариотическим организмам, в частности от растений к бактериям, могут служить данные, полученные при сопоставлении последовательностей нуклеиновых кислот и белков некоторых бактерий и растений.

Все три процесса обмена генетической информацией у микроорганизмов давно и хорошо известны, однако до недавнего времени они изучались в основном только в искусственно созданных условиях лабораторного эксперимента (специально подобранные питательные среды для выращивания бактерий, оптимальные для жизнедеятельности бактерий условия культивирования). Какова вероятность миграции встроенного генетического материала от трансгенной бактерии к диким популяциям бактерий или от трансгенного растения к почвенным бактериям? Последняя разновидность горизонтального переноса вызывает наибольшие опасения из-за распространенности растительных ГМО и их тесного контакта с почвенными микроорганизмами, что повышает опасность передачи их маркерных генов устойчивости к антибиотикам, нежелательных с точки зрения биобезопасности для здоровья человека и домашних животных, почвенным микроорганизмам.

При конъюгации две клетки, обменивающиеся генетической информацией, находятся в непосредственном контакте (через пили у грамотрицательных бактерий и ДНК- транспортные поры у грамположительных бактерий). При трансдукции чужеродная ДНК защищена белковой оболочкой бактериофага. Таким образом, как при конъюгации, так и при трансдукции переносимая ДНК относительно защищена от окружающей среды, что повышает вероятность осуществления этих двух процессов в природе.

Действительно, экспериментально подтверждена передача плазмид в нестерильной почве от Bradyrhizobium japonica к нескольким штаммам бактерий разных видов рода Bradyrhizobium. Эксперименты также выявили определенную специфичность в переносе плазмид в отношении определенных штаммов бактерий, влияние на частоту конъюгации температуры, при которой протекал процесс, механического и химического состава почвы . Таким образом, показана возможность миграции генов посредством конъюгации в почве, несмотря на существующие физиологические барьеры между бактериями, а также воздействие средовых факторов.

Основным механизмом переноса хромосомной и плазмидной ДНК между бактериями в природе является трансдукция. В лабораторных условиях этот процесс отмечен у большого числа свободноживущих в природе бактерий, в том числе и хорошо изученной бактерии E.coli. Однако перенос ДНК к этой бактерии - явление крайне редкое. Были подтверждены случаи переноса ДНК между грамотрицательными бактериями и в почве. В группе бактерий Rizobia, в настоящее время представляющих наибольший интерес для трансгенеза с целью последующего выпуска в окружающую среду, было показано наличие общей трансдукции некоторыми фагами бактерий Rhizobium meliloti, R.leguminosarum и Bradyrhizobium japonicum, а также специфическая трансдукция определенными фагами R. meliloti. Во всех описанных случаях трансдукция происходила при участии умеренных лизирующих фагов. Таким образом, можно говорить о достаточно большой вероятности переноса генетической информации между бактериями группы Rizobia в природе.

В отличие от первых двух способов обмена генетической информацией, трансформация осуществляется посредством свободной, незащищенной от воздействия средовых факторов ДНК. Поэтому природная трансформация между бактериями в почве маловероятна. Действительно, до сих пор не было зафиксировано случаев трансформации между бактериями группы Rizobia в почве, хотя экспериментально (в почвенном экстракте) была показана возможность трансформации Pseudomonas stutzeri и Acinetobacter calcoaceticus. Способными к трансформации считаются более 40 видов бактерий, характерных для различных экосистем.

Очевидно, что обмен фрагментами ДНК более вероятен между штаммами внутри одного вида, чем между разными видами или более отдаленными систематическими группами. Эффективность обмена между отдаленными неродственными микроорганизмами в экосистеме почвы будет определяться возможностью интеграции чужеродной ДНК в новом геноме (ей может препятствовать инсерция, рестрикция или модификация чужеродной ДНК в клетках нового хозяина), ее представительством у нового хозяина и возможностью последующей экспрессии. На вероятность обмена ДНК между бактериями могут повлиять: количество бактерий в объеме почвы (плотность размещения клеток); физиологическое состояние бактерий (компетентность к восприятию ДНК); количество фагов, характерных для бактерий, живущих на этом участке и плотность фагов; концентрация жизнеспособной (не деградированной) ДНК в почве; активность нуклеаз, находящихся в почве; температура, питательный и механический состав почвы.

Несмотря на высокую вероятность переноса трансгенов от ГММ к диким сородичам, последствия такого переноса не должны оказывать существенного негативного влияния на природные популяции бактерий и других организмов. С одной стороны, процессы конъюгации, трансдукции и трансформации являются очень важными для эволюции бактерий, способствуя увеличению их экологической стабильности. Это, в свою очередь значительно повышает адаптивность бактерий в изменяющихся природных условиях и позволяет им колонизировать разнообразные экосистемы. С другой стороны, как было показано выше, небольшое разнообразие трансгенных микроорганизмов, которые предназначены для выпуска в окружающую среду и специфика генетических модификаций, не представляющих серьезной экологической опасности и не дающих микроорганизмам существенных адаптивных преимуществ, позволяют рассматривать перенос используемого в настоящее время трансгенного материала между бактериями как источник приемлемого и регулируемого риска.

Трансформация может быть не только механизмом переноса генетического материала между бактериями. Она считается наиболее вероятным механизмом передачи ДНК растений, в частности трансгенных, к бактериям почвы. Предполагается, что горизонтальный перенос может происходить посредством восприятия компетентными бактериями фрагментов ДНК, высвобожденной из остатков растений, попадающих в почву. Попадая в бактериальную клетку, одноцепочечная ДНК может быть интегрирована в бактериальный геном в результате рекомбинации гомологичных участков, или формировать автономно реплицирующиеся элементы (плазмиды).

Теоретическая возможность трансформации бактерий тотальной ДНК растений и ДНК, содержавшейся в гомогенате растений, была показана экспериментально. В частности, была осуществлена трансформация почвенной бактерии Acinetobacter sp BD413, содержавшей ген nptII c делецией 10 пар нуклеотидов (нарушение функции гена) посредством ДНК, содержавшей функционально активный ген устойчивости к антибиотику канамицину nptII из гомогената картофеля, табака, свеклы, томата и рапса масличного. Такая трансформация приводила к полному восстановлению функции гена у бактериальных клеток, что говорит о возможности передачи маркерных признаков устойчивости к антибиотикам от трансгенных растений к почвенным бактериям и доказывает возможность рекомбинации комплементарных участков ДНК бактерий и минерализованных растений. Однако частота такой рекомбинации была очень низкой.

Первым условием успешной трансформации бактериальных клеток ДНК растений является наличие в почве долгоживущей свободной ДНК. Новые данные изменили ранее сложившееся мнение о быстрой деградации в почве высокомолекулярной ДНК. Неоднократно показано, что ДНК может стабилизироваться, адсорбируясь на частицах глины, полевого шпата, кварца, гуминовых кислот, и таким образом сохраняться в течение нескольких недель, а то и месяцев. Трансформирующую способность она может сохранять, по меньшей мере, в течение нескольких дней. Продлению жизни ДНК в почве способствует медленное разрушение целлюлозных клеточных стенок растений.

Несмотря на достаточно продолжительную жизнь ДНК в почве, вероятность трансформации в природных условиях оценивается большинством авторов как очень низкая. Если ее и удается фиксировать, то только в стерильной почве. В нестерильной почве трансформация бактерий свободной растительной ДНК не обнаружена. Компетентность бактерий к трансформации не является конститутивным (постоянно присутствующим) признаком и ее появление лимитировано многими факторами, как эндогенными (физиологический статус бактерий), так и средовыми (температурой, питательным и механическим составом почвы и т.д.). Конкуренция с другими организмами почвы, очевидно, негативным образом сказывается на компетенции бактериальных клеток к трансформации. Предполагается, что вероятность трансформации в нестерильной почве составляет не более 10^-10 – 10^-11. По мнению других авторов, частота природной трансформации бактериальных клеток растительной ДНК еще ниже - 10^-17. Такая низкая частота трансформации делает возможность горизонтального переноса генов от растений к микроорганизмам почвы, в частности генов устойчивости к антибиотикам, весьма маловероятной.

Дополнительным барьером горизонтального переноса генов от растений к бактериям служит несовпадение регуляторных последовательностей, осуществляющих экспрессию трансформированного генетического материала, прокариотических и эукариотических организмов. Как правило, промоторные последовательности, регулирующие активность трансгенов в растениях, у прокариот обладают очень низкой активностью. Единственным исключением является промотор 35S, выделенный из вируса мозаики цветной капусты (CaMV35S). Увеличение числа экспрессирующихся у бактерий последовательностей может быть вызвано применением новых методов трансгенеза. Например, при обстреле растений из генной пушки возможно встраивание в геном растений целых плазмид, ДНК которых имеет больше шансов экспрессироваться при трансформации в бактериальную клетку. То же касается и хлоропластных геномов, трансгенез которых в настоящее время предлагается как альтернатива ядерному в качестве средства, предотвращающего возможность утечки трансгенов с пыльцой.

Несмотря на крайне низкую вероятность горизонтального переноса трансгенов от растений к бактериям, безопасность тех или иных модификаций для окружающей среды в связи со сменой их носителя должна обязательно рассматриваться согласно принципу принятия мер предосторожности. Вероятность и серьезность этих последствий, как и при вертикальном переносе генов, будет определяться двумя факторами: возникновением у трансформантов дополнительных экологических преимуществ, дающих им возможность существенного популяционного роста и колонизации новых мест обитания и прессингом на популяции других организмов, связанным с экспрессией трансформированного гена (например, появлением у микроорганизмов токсичности). К сожалению, ограниченность имеющихся на сегодняшний день научных сведений об экологии микроорганизмов, в частности почвенных микроорганизмов, не дает нам возможности достаточно точно оценить факторы окружающей среды, которые могут повлиять на способность трансформантов воспринимать новые гены и уверенно предсказать поведение микроорганизмов, связанное с трансформацией генов от неродственных организмов.