Инфракрасная спектрофотометрия

При поглощении света в ИК-области спектра (10³ – 10⁵ нм ) происходят переходы между колебательными уровнями основного состояния молекулы (Рис. 3 ). Спектр поглощения инфракрасного света возникает за счет характеристических движений (изменение длины, величины угла связей) различных функциональных групп (например, метильной, амидной, карбонильной и.т.д). Колебательные спектры очень чувствительны к изменениям химической структуры, конформации, окружения молекулы. В этом смысле инфракрасная спектроскопия не отличается от спектрофотометрии в видимом и ультрафиолетовом свете. И сами ИК-спектрофотометры, принципиально не отличаются спектрофотометров, работающих в области видимого и ультрафиолетового света. Этот метод рассматривается отдельно ввиду того, что имеются некоторые отличия методологического характера.

ИК-спектрофотометр состоит из источника излучений ( металлический стержень, нагретый до 1800 – 2000 ºС ), монохроматора, кюветной камеры с кюветой, детектора излучений (термопара). Главная трудность использования ИК-спектрофотометра для характеристики биологических молекул состоит в том, что для измерения ИК-спектра, нельзя использовать их водные растворы. Вода имеет очень высокий показатель теплоемкости , соответственно, характеризуется высоким коэффициентом поглощения инфракрасного излучения. Водная среда почти полностью поглощает весь спектр инфракрасного света. Поэтому спектры поглощения макромолекул, находящихся в водном растворе, полностью затушевываются поглощением растворителя. Для измерения спектра макромолекул в ИК-спектрофотометре используют метод сухих пленок. Сухие пленки молекул получают выслушиванием их концентрированных растворов на поверхности пластинок. Конечно, при этом необходимо иметь в виду, что структура макромолекулы в сухой пленке существенно отличается от таковой в водном растворе. Вследствие этих ограничений, ИК-спектрофотометрия, не нашла такого широкого применения в биологических исследованиях, как спектрофотометрия в видимом и ультрафиолетовом свете. Однако, несмотря на это, метод ИК-спектрофотометрии внесла и вносит существенный вклад в исследование структуры макромолекул. При изображении спектров поглощения в ИК- свете используется не длина волны λ , а частота ν или волновое число 1/ ν. Приведем некоторые примеры использования этого метода для исследования биологических объектов и процессов.

1. Определение относительного содержания α-спирали, β-структур, беспорядочного клубка в белках по интенсивности так называемых «амидных» полос (по поглощению NH₂ –группы и C=O – группы).

2. Установление количества водородных связей и функциональных групп, участвующих в образовании водородных связей в макромолекулах.

3. Изучение процессов денатурации и ренатурации молекул белков и НК по изменению числа водородных связей.

4. Определение относительного содержания А-Т (У) и Г-Ц в молекулах нуклеиновых кислот.

5. Изучение взаимодействия между небольшими молекулами, например, белка с лигандом, фермента с ингибитором и т.д.