Проблемы беккроссирования соматических гибридов культурным родителем и способы их решения

Несмотря на то, что в литературе обсуждаются широкие возможности соматической гибридизации путем слияния протопластов для решения различных фундаментальных и прикладных задач, практический интерес представляет, прежде всего, применение этой технологии для вовлечения в селекцию ценного генофонда диких сородичей культурных растений, половая гибридизация с которыми сильно затруднена. Наибольшие успехи достигнуты при использовании соматической гибридизации в селекции такой важной сельскохозяйственной культуры, как картофель. С помощью этой технологии получены гибриды между культурным картофелем и такими отдаленными в систематическом отношении видами, как неклубненосные S. brevidens (palustre), S. etuberosum, 1 EBN диплоидные дикие виды S. bulbocastanum, S. pinnatisectum, S. tarnii, S. cardiofilum, S. polyadenium, S. circaeifolium, S. commersonii, которые несут ценные гены устойчивости к вирусам, нематодам, фитофторозу, бактериальным болезням, заморозкам [Яковлева 2012].

Однако получение соматических гибридов является лишь первым шагом на пути интрогрессии генофонда диких видов в селекционный материал, так как первичные гибриды требуют последующей селекционной доработки путем беккроссирования культурным видом. Во многих случаях беккроссирование соматических гибридов сортами с целью дальнейшего вовлечения их в селекционный процесс сильно затруднено. Рассмотрим на примере картофеля основные трудности, связанные с беккроссированием соматических гибридов, и способы их преодоления.

Соматические гибриды между культурным картофелем и неклубненосными видами S. brevidens (palustre), S. etuberosum фактически представляют собой аллополиплоиды, у которых из-за значительных геномных различий родительских видов происходит конъюгация преимущественно между гомологичными хромосомами. В связи с этим сильно затруднена интрогрессия в селекционный материал ценных генов диких видов путем рекомбинации в мейозе. У беккроссов таких гибридов с культурным картофелем хромосомы дикого родителя оказываются в унивалентном состоянии, из-за чего передаются потомству случайным образом. В результате уже после двух-трех беккроссов в селекционном материале сохраняются, в лучшем случае, лишь единичные хромосомы дикого родителя. В связи с этим предполагается, что интрогрессия ценных генов от неклубненосных видов культурному картофелю в основном возможна путем получения трисомных (имеющих геном культурного картофеля и отдельные дополнительные хромосомы дикого вида), тетрасомных (имеющих дополнительную пару хромосом дикого вида), или замещенных по отдельным хромосомам линий (одна из пары гомологичных хромосом культурного картофеля замещена парой гомеологичных хросом дикого вида). Поддерживать такие линии путем вегетативного размножения несложно. Однако при вовлечении их в гибридизацию для использования в селекции необходимо постоянно контролировать передачу потомству хромосом дикого вида.

Соматические гибриды между культурным картофеля и дикими видами с гомологичными геномами в большинстве случаев несут факторы пре- и постзиготной межвидовой несовместимости, характерные для родительских видов. Так, тетраплоидные соматические гибриды между дигаплоидами S. tuberosum и S. pinnatisectum, S. bulbocastanum не скрещивались с сортами культурного картофеля. Это обусловлено, прежде всего, тем, что рост пыльцы S. tuberosum ингибируется в пестиках соматических гибридов (презиготная несовместимость). Исходя из предложенной нами гипотезы, описывающей механизм действия презиготной несовместимости, при использовании соматических гибридов в качестве материнской формы беккроссирование не может быть успешным, так как в пестиках таких гибридов присутствуют РНКазы, которые являются продуктами S-генов обоих родительских видов). S-РНКазы дикого вида не могут быть дезактивированы факторами ингибиторования S-РНКаз, присутствующими в пыльцевых трубках S. tuberosum, что приводит к развертыванию реакции несовместимости [Ермишин и др., 2006].

Проблемы при использовании таких соматических гибридов в селекции могут быть связаны также с постзиготными барьерами, поскольку они, по-видимому, имеют балансовое число эндосперма, отличное от 4 (EBN культурного картофеля), что может быть одной из причин неудач их беккроссирования сортами картофеля. Пентаплоидные и гексаплоидные гибриды, имеющие в своем составе увеличенное по сравнению с диким видом количество геномов S. tuberosum, беккроссируются S. tuberosum легче. Это объясняют, прежде всего, тем, что EBN таких соматических гибридов ближе к EBN культурного картофеля, чем в случае тетраплоидных соматических гибридов. Увеличение дозы геномов культурного картофеля у таких соматических гибридов должно также ослабить презиготные барьеры, обусловленные наличием пестичных РНКаз – продуктов S-генов дикого родителя.

Однако эффективность интрогрессии ценного генофонда диких видов в селекционный материал картофеля при использовании высоко полиплоидных соматических гибридов имеет ряд недостатков. Требуется достаточно длительное время для снижения уровня плоидности селекционного материала до тетраплоидного уровня. Отбор по селекционно-ценным признакам проводится среди полиплоидного и анеуплоидного селекционного материала, для которого характерно сложное расщепление. В связи с этим использование в селекции тетраплоидных соматических гибридов, перевод материала на диплоидный уровень представляется более перспективным.

Для того чтобы обойти или преодолеть презиготные факторы межвидовой несовместимости, сохраняющиеся у соматических гибридов, в лаборатории генетики картофеля ИГиЦ НАН Беларуси предложен ряд подходов.

Подход 1. Использование первичных соматических гибридов в качестве опылителей в скрещиваниях с сортами картофеля. В популяции пыльцы обязательно будут генотипы без S-генов дикого вида и благодаря этому способные расти в пестиках S. tuberosum (рисунок 8.2).

Подход 2. Снижение плоидности соматических гибридов (получение дигаплоидов с использованием гаплопродюсеров S. phureja). Предполагается, что среди дигаплоидов будут выщепляться гомозиготы по S-генам S. tuberosum, которые будут совместимы в качестве материнской формы в скрещиваниях с дигаплоидами культурного картофеля (рисунок 8.2).

Подход 3. Получение дигаплоидов или удвоенных дигаплоидов в культуре пыльников соматических гибридов. Этот подход предлагается использовать для соматических гибридов S. tuberosum + S. bulbocastanum, которые непосредственно не скрещиваются с S. phureja из-за жесткой презиготной несовместимости.

Скрещивания с использованием соматических гибридов в качестве опылителей (первый подход), как правило, оказываются результативными.Этот подход, в частности, реализован Carrasco et el. (2002) с гибридами S. tuberosum + S. pinnatisectum (4х). Однако его возможности ограничены обычной для соматических гибридов мужской стерильностью, возникающей в результате нарушений в ходе мейоза при формировании микроспор.

Второй подход был успешно реализован в лаборатории генетики картофеля ИГиЦ НАН Беларуси при работе с гибридами S. tuberosum + S. pinnatisectum (4х) [Ермишин и др., 2006]. С помощью опыления этих гибридов пыльцой гаплопродюсера S. phureja IvP35 были получены 10 дигаплоидов. Все они успешно завязывали ягоды при опылении их смесью пыльцы фертильных дигаплоидов S. tuberosum, ягоды содержали зрелые жизнеспособные семена. Таким образом, полученные формы легко скрещивались с дигаплоидами S. tuberosum, т.е. между ними отсутствовали как пре-, так и постзиготные межвидовые барьеры, характерные для исходных видов.

Для соматических гибридов S. tuberosum + S. bulbocastanum (4х), которые несовместимы с S. phureja, был использован третий из названных подходов [Ермишин и др., 2008]. С целью получения гомозигот по S-генам культурного родителя было получены растения-регенеранты (андроклоны) в культуре пыльников соматических гибридов S. tuberosum + S. bulbocastanum. Анализ их плоидности показал, что все они являются тетраплоидами (удвоенными дигаплоидами), то есть использованная методика культуры пыльников не дает возможности получать дигаплоиды гибридов. Для снижения плоидности андроклонов использовали опыление гаплопродюсером S. phureja IvP35. Результаты гибридизации андроклонов соматических гибридов с S. phureja, а также данные по анализу роста пыльцевых трубок при опылении андроклонов смесью пыльцы сортов картофеля, свидетельствуют о том, что часть из них хорошо совместимы с пыльцой использованных опылителей и, следовательно, имеется возможность преодоления презиготных репродуктивных барьеров.

Тем не менее, андроклоны, в пестиках которых наблюдался нормальный рост пыльцевых трубок культурного картофеля, не завязывали жизнеспособных семян при опылении их смесью пыльцы сортов картофеля. Это очевидно связано с тем, что эффективная плоидность андроклонов (EBN), как и исходных соматических гибридов, отличается от 4, из-за чего происходит нарушение развития эндосперма гибридных семян. И только снижение уровня плоидности андроклонов позволило преодолеть постзиготные барьеры. Среди отобранных диплоидных сеянцев от опыления андроклонов гаплопродюсером IvP35 один оказался достаточно жизнеспособным и имел удовлетворительную интенсивность цветения. Он хорошо скрещивался с дигаплоидами S. tuberosum, образуя выполненные семена, имеющие высокую всхожесть. Это говорит о том, что полученный дигаплоид соматического гибрида является гомозиготой по S-генам культурного картофеля и его эффективная плоидность (EBN) равняется 2.

Как видим, снижение плоидности соматических гибридов такого типа (предположительно имеющих 3 EBN) позволяет получать формы, которые нормально скрещиваются с дигаплоидами картофеля (2 EBN). По-видимому, в результате мейоза соматических гибридов или их андроклонов происходит образование гамет с разным EBN (расщепление по EBN). Гибридизация с гаплопродюсером обеспечивает отбор гамет с 2 EBN, что позволяет получить выполненные семена дигаплоидов соматических гибридов.

Интересный подход к вовлечению в селекцию соматических гибридов картофеля предложил V.-M. Rokka (1998). У соматических межвидовых гибридов, которые сложно беккроссировать культурным картофелем, получают с помощью культуры пыльников гаплоиды (соматогаплоиды), которые затем используют в качестве одного из родителей при соматической гибридизации с дигаплоидами культурного картофеля. В результате получают вторичные соматические гибриды, в геноме которых преобладают хромосомы культурного родителя. Этот подход был реализован при получении соматических гибридов с участием таких диких видов картофеля, как неклубненосный S. brevidens и аллотетраплоидный S. acaule. В принципе, процедуру «насыщения» генома гибридов генетическим материалом S. tuberosum с помощью данной технологии можно проводить в несколько циклов. Однако она, как видим, является технически весьма сложной. В случае гибридов с такими видами, как S. brevidens, неизвестно, какие из хромосом дикого вида сохранятся у соматических гибридов (см. выше начало этого раздела).

Дополнительная литература

1. Глеба Ю.Ю., Сытник К.М. Клеточная инженерия растений. Киев.: Наукова думка. 1984.- 160 с.

2. Яковлева Г.А. Cоматическая гибридизация и клеточная селекция картофеля (Solanum tuberosum L.)/ Генетические основы селекции растений. В 4 т. Т.3. Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия/науч. ред. А.В. Кильчевский, Л.В. Хотылева. – Минск: Беларус. Наука, 2012. С.217-250.

3. Orczyk W., Prztakiewicz J., Nadoloska-Orczyk A. Somatic hybrids of Solanum tuberosum – application to genetics and breeding//Plant Cell Tissue Organ Cult. 2003. V.74. P 1-13.

Заключение

Наиболее эффективным методом расширения генетической основы селекционного материала является гибридизация его с дикими и примитивными культурными родственными видами (отдаленная гибридизация). Однако во многих случаях скрещивания между культурными и дикими видами связаны со значительными проблемами, вызванными естественными межвидовыми барьерами. Наиболее существенными барьерами являются геномные различия между видами, различия в плоидности, барьеры, препятствующие гибридизации (пре- и постзиготные репродуктивные барьеры). Для их преодоления разработаны специальные приемы, основанные, в том числе, на применении методов культуры клеток и протопластов in vitro.

Опыление in vitro используют, прежде всего, для преодоления презиготной несовместимости при межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. Метод включает: обнажение семяпочки или семяпочек путем удаления тканей пестика и завязи, нанесение на них пыльцы и культивирование оплодотворенных семяпочек на питательной среде до образования зрелых семян. Было предложено несколько вариантов метода: опыление и культивирование изолированных завязей, семяпочек, прикрепленных к плаценте, семяпочек без плаценты. Подобно оплодворению в пробирке у животных, удалось добиться выделения и слияния in vitro единичных женских и мужских гамет и регенерации из продуктов слияния растений (Kranz, Lorz, 1993). Был разработан метод химического слияния гамет (с помощью CaCl₂), который обеспечивал высокую частоту (около 80%) слияния преимущественно женских гамет с мужскими [Faure et al. 1994]. Культура оплодотворенных завязей оказалась весьма эффективным приемом для получения межвидовых и даже межродовых гибридов в комбинациях, которые ранее не удавались из-за постгамной несовместимости (гибели зародыша на ранних стадиях развития из-за несовместимости с эндоспермом, раннего опадания плодов). С помощью этого метода были получены ценные для селекции межвидовые гибриды хлопчатника, клевера, подсолнечника.

Культура in vitro зиготических зародышей («embryo rescue» - спасение зародышей) позволяет предотвратить их гибель из-за нарушения питания, например, из-за недоразвитого эндосперма гибридного семени. Метод широко используется в селекции для целей межвидовой гибридизации риса, фасоли, томатов, картофеля, лилий, донника и других культур. Этот метод используют также при получении гаплоидов путем опыления пыльцой гаплопродюсеров, облученной пыльцой (см. 7.8), для прерывания периода покоя семян и других целей.

Зародыши вычленяют в стерильных условиях из гибридных семян, помещают их на питательную среду и при культивировании на свету добиваются регенерации из них растений. Эффективность регенерации растений в значительной степени зависит от размера эксплантата и стадии развития зародыша: чем больше эксплантат и чем более зрелый зародыш, тем выше вероятность регенерировать из него растение. Для культуры мелких зародышей на ранних стадиях развития используют обогащенные питательные среды, а также получают из них каллюс, из которого затем регенерируют растения

Использование методов соматической гибридизации путем слияния протопластов открывает новые возможности в области отдаленной гибридизации. Технология соматической гибридизации включает следующие этапы: получение суспензий протопластов двух видов растений, гибриды между которыми предполагается получить, получение смешанной суспензии протопластов двух видов и использование экспериментальных воздействий (химических или электрических), обеспечивающих слияние протопластов, отбор продуктов слияния, получение из них каллюсной культуры и регенерация растений соматических гибридов, подтверждение их гибридности.

Изолированные протопласты, как правило, являются одноименно (отрицательно) заряженными частицами. Поэтому для того, чтобы они сблизились и произошло слияние протопластов разных видов, в питательную среду к суспензии протопластов добавляют определенные вещества («фьюзогены» от англ. fusion - слияние) или суспензию подвергают воздействию электрического тока. Наибольшее распространение получили следующие системы слияния протопластов: высокая концентрация в среде ионов Ca²⁺ (около 50 мМ) и высокая рН (9-11) при 37^оС; добавка в среду полиэтиленгликоля (ПЭГ); сочетание ПЭГ + высокая концентрация ионов Ca²⁺ и высокая рН.

Электрослияние протопластов осуществляют в специальной кювете прибора с двумя электродами. Через питательную среду, в которую помещают суспензию протопластов двух видов, пропускают высоковольтные импульсы. Параметры электрического поля и продолжительность его действия в каждом случае подбирают экспериментально. Под действием тока на электродах образуются агрегаты из 2-3 протопластов, либо цепочки из 5-6 протопластов между электродами. В это время на электроды подают единичные импульсы постоянного тока, которые приводят к образованию пор в сильно сжатых мембранах протопластов. В результате происходит перемешивание цитоплазмы контактирующих протопластов и образуются гибридные протопласты.

Поскольку существующие методы обеспечивают высокую частоту слияния протопластов, можно получить большое количество растений-регенерантов и проводить отбор гибридов на организменном уровне. Однако во многих случаях гибриды сложно отличить от родительских форм, поэтому их отбор рекомендуется проводить на уровне клеток, применяя следующие подходы. Механическая изоляция: используют морфологически различные типы родительских протопластов, например, протопласты из каллюсных клеток и мезофилла листа. После слияния гибридные протопласты выявляют визуально под микроскопом, изолируют микропипеткой и с помощью микроманипулятора переносят в отдельную каплю обогащенной питательных среды. Генетическая комплементация: если слить протопласты мутантов, гомозиготных по разным рецессивным генам, полученные соматические гибриды в силу гетерозиготности по этим генам будут иметь фенотип дикого типа (нормальный). Отбор гибридов проводят на клеточном уровне или среди растений-регенерантов. Для целей соматической гибридизации растений чаще всего используют генетическую комплементацию с участием хлорофилл дефектных мутантов, которые нередко специально для этого получают, а также ауксотрофных мутантов. Физиологическая комплементация основана на способности гибридных клеток делиться и переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки, или клетки одного из родительских видов этого делать не в состоянии. При этом неспособность родительских культур клеток к росту и морфогенезу не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является их нормальной физиологической реакцией на условия культивирования. Инактивация протопластов одного из родителей до слияния протопластов ионизирующим излучением или биохимическими ядами, необратимо подавляющих метаболизм клетки. В гибридных клетках способность к делению и морфогенезу в культуре in vitro восстанавливается. Физическое обогащение заключается в разделении протопластов после слияния с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Физическое обогащение позволяет повысить эффективность других методов селекции, например, генетической комплементации.

В результате слияния протопластов двух видов растений могут быть получены соматические гибриды, у которых полностью представлены геномы обоих родительских видов (симметричные гибриды), полностью сохраняется геном только одного из видов и отдельные хросомосомы второго вида (асимметричные гибриды), геном одного из родителей, а также ДНК пластид и митохондрий обоих родителей, либо родителя, хромосомы которого утрачены (цибриды или цитоплазматические гибриды). Полученные соматические гибриды подлежат обязательному изучению: проводят исследование морфологических признаков, оценку селекционной ценности гибридов, анализ изоферментов, различных ДНК-маркеров, применяют цитогенетические методики, например, метод геномной in situ гибридизации (GISH).

Получение соматических гибридов является лишь первым шагом в интрогрессии генофонда диких видов в селекционный материал, так как первичные гибриды требуют последующей селекционной доработки путем беккроссирования культурным видом. Во многих случаях беккроссирование соматических гибридов сильно затруднено. Соматические гибриды могут представлять собой аллополиплоиды, у которых из-за значительных геномных различий родительских видов происходит конъюгация преимущественно между гомологичными хромосомами. Интрогрессия ценных генов от дикого вида культурному при использовании таких гибридов в основном возможна путем получения трисомных, тетрасомных, или замещенных по отдельным хромосомам линий.

Соматические гибриды в большинстве случаев несут факторы пре- и постзиготной межвидовой несовместимости (пре- и постзиготные межвидовые барьеры), характерные для родительских видов. Увеличение дозы геномов культурного родителя у таких соматических гибридов позволяет их ослабить и получить в результате беккроссное потомство в скрещиваниях с культурным видом. Однако эффективность интрогрессии ценного генофонда диких видов в селекционный материал при использовании высоко полиплоидных соматических гибридов требует достаточно длительное время для снижения уровня плоидности селекционного материала до уровня плоидности культурного вида, отбор по селекционно-ценным признакам проводится среди полиплоидного и анеуплоидного селекционного материала, для которого характерно сложное расщепление. Для того, чтобы обойти или преодолеть факторы межвидовой несовместимости, сохраняющиеся у соматических гибридов, предлагается ряд подходов, позволяющих добиться расщепления по этим факторам: использование, если это возможно, соматических гибридов в качестве опылителей в скрещиваниях с культурным видом, снижение их плоидности с помощью гаплопродюсеров или культуры пыльников.

Вопросы для повторения

1. Назовите основные факторы, обеспечивающие обособление видов, которые препятствуют межвидовой гибридизации.

2. Какие механизмы лежат в основе презиготной самонесовместимости и межвидовой несовместимости?

3. Что такое эффективная плоидность (балансовое число эндосперма), какова его роль в межвидовой гибридизации растений?

4. В чем состоит методика опыления in vitro и для каких целей ее используют в селекции растений?

5. Опишите методику культуры незрелых зародышей. Приведите примеры ее применения в селекционно-генетических исследованиях.

6. Назовите основные методы слияния протопластов, которые используют с целью получения соматических гибридов?

7. Какие методы отбора продуктов слияния протопластов применяют в соматической гибридизации?

8. Что из себя представляют ассиметричные соматические межвидовые гибриды, цибриды? Каким образом они могут быть получены?

9. Какие факторы могут затруднять вовлечение в селекцию соматических межвидовых гибридов?

10. Назовите подходы, применяемые для повышения эффективности беккроссирования соматических гибридов культурным родительским видом.