КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

Одним из наиболее важных направлений биотехнологии является клеточная инженерия растений или клеточная биотехнология, которая заключается в получении растений из одной клетки, а также в генетических манипуляциях с изолированными клетками, направленными на преобразование их генотипов. Клеточная биотехнология базируется на способности клеток к существованию и размножению в условиях in vitro, их тотипотентности и регенерации.

Тотипотентность растительных клеток. Растительные клетки в отличие от клеток животных обладают свойством тотипотентности, на основании которого из одной клетки могут быть регенерированы фертильные растения. Идея о тотипотентности любой растительной клетки была выдвинута Г. Хаберландом (1902).

Любая растительная клетка, а не только оплодотворенная яйцеклетка, обладает одинаковыми потенциальными возможностями, так как содержит весь набор генов и, следовательно, клетки сохраняют свойственную зиготе программу развития, поэтому могут регенерировать в целое растение. Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так как потенциальные возможности клеток разных типов проявляются неодинаково. В некоторых из них гены в сильной степени репрессированы, в связи с чем проявление тотипотентности становится ограниченным.

Используя системы in vitro, можно реализовать тотипотентность клетки высшего растения одним из двух путей: 1) индукцией в каллусных тканях или культивируемых клетках цепи событий, связанных с образованием меристематических очагов, развитием на их основе зачатков стеблевых апексов, появлением побегов, которые после укоренения развиваются в целое растение; 2) индукцией развития клетки по пути зародышевой структуры, образующей проросток и растение.

Дедифференцировка как основа каллусогенеза. Через некоторое время при культивировании на питательной среде в условиях in vitro эксплантированных клеток и тканей наблюдается процесс их дедифференцировки и образуется первичный каллус (каллусная ткань).

Дедифференцировка – это потеря клеточных структур, выполняющих специфические функции, и возвращение дифференцированных клеток в меристематическое состояние, в котором они сохраняют способность к делению.

У интактных растений дефифференцировка и образование каллусной ткани происходит при поранении растения вследствие образования раневых гормонов. Индукторами дедифференцировки и процессов деления клетки в условиях in vitro служат добавленные в питательную среду гормоны – ауксины и цитокинины. Переход клетки в условиях in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцированному и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигенной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток.

Дедифференцировка начинается с использования запасных питательных веществ (крахмала, белков, липидов) и разрушения специальных клеточных органелл, в частности хлоропластов. Через 6-12 часов после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, число элементов аппарата Гольджи, а также размеры и число ядрышек. В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех видов РНК, начинается репликация ДНК, исчезают тканеспецифичные белки и появляются белки, характерные для делящихся клеток. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые начинаются через 48-72 часа после индукции дедифференцировки.

Клетка начинает делиться и образуется каллус. Каллус (каллусная ткань) – это ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений. Сам процесс образования каллуса называется каллусогенезом. Пролиферация – новообразование клеток путем размножения.

Особенности каллусных клеток. Каллусная ткань – основной тип ткани, получаемой при культивировании в условиях in vitro изолированных клеток и тканей растений. Каллусная ткань представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющих определенной анатомической структуры. В зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции:

- рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающейся на отдельные мелкие агрегаты;

- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

- плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.

Каллусная ткань в условиях in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже зеленоватого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску. Темно-коричневая окраска возникает чаще при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов.

Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки (деление, растяжение, дифференцировка, старение, отмирание). Для того чтобы не происходило старение и отмирание каллусных клеток, через каждые 4-6 недель на свежую питательную среду переносят первичный каллус, возникший на эксплантах – фрагментах ткани или органа, которые были выделены и помещены на питательную среду. Эту операцию называют пассивированием. При регулярном пассивировании способность к делению может поддерживаться в течении десятков лет.

Каллусные клетки имеют много общего с нормальными клетками растений, входящими в состав растительного организма:

1) Рост каллусных клеток подчиняется общим закономерностям и описывается ростовой кривой Сакса. Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму. Кривая роста включает пять фаз. Во время 1-й латентной или лаг-фазы не происходит увеличения числа или массы клеток. Клетки в этот период подготавливаются к делениям. Следующая, 2-я фаза – логарифмическая или экпоненциального роста – характеризуется наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллусной ткани, кроме того, их рост происходит с ускорением. Во время 3-й линейной фазы скорость роста клеток постоянна. Далее наступает 4-я фаза – замедленного роста, когда митотическая активность каллусных клеток резко снижается. В 5-й – стационарной фазе – ростовая кривая выходит на плато. В этот период начинается деградация клеток, однако она еще уравновешивается возрастанием числа клеток за счет их деления. В целом же скорость нарастания клеточной массы во время 5-й фазы равна нулю. После стационарной фазы наступает отмирание (деградация) клеток, во время которой число и масса живых каллусных клеток уменьшается.

2) Каллусные клетки сохраняют многие физиолого-биохимические черты, свойственные нормальным клетка. Например, способность к синтезу вторичных метаболитов, морозостойкость, устойчивость к высоким температурам, засолению и др.

3) Каллусным клетка свойственна также фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности фитохрома.

Вместе с тем каллусные клетки обладают свойствами, отличающими их от нормальных клеток:

1) физиологическая асинхронность, т.е. рост каллусных клеток происходит асинхронно, неорганизованно и является неограниченным, в связи с этим в каллусной ткани присутствуют различные по возрасту клетки;

2) генетическая гетерогенность, т.е. генетическая нестабильность клеток каллусной ткани, выражающаяся в различной плоидности, в появлении хромосомных аберраций, генных мутаций;

3) более длительный клеточный цикл чем у клеток растения, произрастающего в открытом грунте;

4) митохондрии в каллусной клетке также, как и в меристематической, являются слабо развитыми, в них мало крист, что сказывается на активности аэробного дыхания;

5) изменения в энергетическом обмене, направленные в сторону уменьшения потребления кислорода и усиления процессов брожения;

6) наряду с изменением характера дыхания в каллусных клетках в направлении усиления бескислородного расщепления углеводов, происходит также сдвиг в сторону пентозофосфатного пути, который является источником пентоз, необходимых для делящихся клеток.

Способы культивирования каллусных клеток и тканей – поверхностное и глубинное культивирование. Если культивирование происходит поверхностно на агаризированной (твердой) питательной среде, то образуется каллусная ткань. Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, обычно называют суспензионными культурами.

Суспензионная культура представляет собой отдельные клетки, или небольшие группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Для этого применяют различную аппаратуру и способы поддержания их во взвешенном состоянии. Суспензионную культуру получают путем переноса каллусной ткани с твердой среды в колбу с жидкой питательной средой, либо непосредственно из запасающей паренхимы растений. Однако последний способ глубинного культивирования более длительный и трудоемкий.

Особенности морфогенеза каллусных клеток. Ход нормального развития растений полностью меняется в условиях in vitro. Остановка реализации исходной генетической программы клеток и тканей при культивировании в условиях in vitro приводит к дедифференцировке и пролиферации их в новом направлении. Признаки, характеризующие прохождение культивируемыми клетками отдельных этапов морфогенеза, еще недостаточно изучены, что не позволяет в настоящее время пока использовать культуру клеток и тканей в полной мере.

Морфогенез считается одним из самых сложных биологических явлений, обусловленных тотипотентностью клетки. Морфогенез – это процесс формирования органов (органогенез), тканей (гистогенез) и клеток (цитогенез, или клеточная дифференцировка).

Существует несколько гипотез о причинах перехода к формированию структур в культуре неорганизованно растущих клеток. Каждая из изложенных гипотез объясняет процесс морфогенеза лишь частично, но ни одна не может пока объяснить процесс в целом.

По первой из них, высказанной Ф. Скугом и Е. Миллером (1957) и нашедшей подтверждение в опытах с каллусной тканью табака, поведение культивируемых клеток определяется концентрацией и соотношением внесенных в питательную среду стимуляторов роста ауксиновой и цитокининовой природы. Преобладание ауксинов над цитокининами стимулирует образование корней, обратное соотношение приводит к появлению зачатков стебля, а примерно равное поддерживает активный неорганизованный рост клеток. Таким образом, различия в балансе экзогенных гормонов ауксинового и цитокининового типа определяет, с одной стороны, возможность перехода клетки в культуре к дедифференцировке и неорганизованной пролиферации, а с другой – индукцию вторичной дифференцировки того или иного типа морфогенеза.

По мнению Стэварда (1958) сам процесс изолирования клетки и культивирования ее вне организма служит причиной перехода ее к морфогенезу, т.е. стимулирует реализацию ее тотипотентности. Подтверждением этой гипотезы является соматический эмбриогенез – процесс образования зародышеподобных структур (эмбриоидов) в культуре клеток и тканей. Независимость соматического эмбриогенеза от экзогенных гормонов обусловлена тем, что развивающийся эмбриоид сам обеспечивает себя ими. Таким образом, основными стимулами морфогенеза являются изменения соотношения гормонов в питательной среде, а также сам процесс изоляции растительной клетки от организма.

Экспериментальное изучение способности различных генотипов в пределах вида к морфогенезу в условиях in vitro показало, что в пределах каждого вида можно выделить генотипы резко контрастные по способности каллусных клеток к морфогенезу. Это свидетельствует о том, что данный признак контролируется генотипом. Расщепление потомства, полученного при скрещивании контрастных по способности к морфогенезу в условиях in vitro генотипов, позволяет судить о доминантности или рецессивности этого признака, моногенном или полигенном его характере. Скрещивание генотипов, морфогенетически активных в условиях in vitro, может увеличить регенерационную активность каллусов, полученных из тканей их потомства. Рядом исследователей продемонстрированы результаты, доказывающие, что кроме генотипа, важную роль играет характеристика исходной для получения каллуса ткани.

Таким образом, изучение морфогенеза у различных видов в культуре in vitro позволило сделать вывод о том, что данный процесс генетически обусловлен, а способность к реализации генетического потенциала зависит от степени дифференцировки клеток экспланта, взятого для получения каллусной культуры. Кроме того, процесс развития растения из соматической клетки носит вероятностный характер и может начаться только при совпадении целого ряда обстоятельств. Среди них выделяют: способность генотипа к индукции морфогенетических процессов в культуре in vitro; эпигенетическое состояние клеток, зависящее от характера ткани, из которой культивируемые клетки были получены; компетентность конкретной культивируемой клетки принять сигнал к перестройке программы развития и ответить на него.

Вместе с тем было выяснено, что в реализации наследственных возможностей к морфогенезу принимает участие еще один важный фактор – физиологическое влияние условий выращивания in vitro. Из трофических факторов сильнее всего влияют на морфогенез азотсодержащие вещества. Присутствие ионов аммония в питательной среде важно для индукции процесса морфогенеза, тогда как наличие нитрат-ионов важно для дальнейшего развития структур. Аминокислоты усиливают процессы соматического эмбриогенеза. Влияют на морфогенез и условия освещения, но уже на стадии развития регенеранта, а не на стадии индукции процесса, которая может происходить в темноте. Для индукции разных форм морфогенеза широко используются цитокинины и ауксины. Однако успешное использование различных стимуляторов роста растений все же не дает ответа на вопрос, являются ли они сигналом к перепрограммированию неорганизованно делящейся клетки на выполнение программы развития.

При вариации названных условий выращивания можно установить оптимум морфогенеза для различных генотипов в условиях in vitro.