Биохимические свойства бактерий

Бактерии синтезируют разнообразные ферменты, принадлежащие к 6 классам. Ферментный состав любого микроба определяется его геномом и является довольно стабильным признаком. Поэтому определение сахаролитических, протеолитических и других ферментов, образуемых определенными видами и даже вариантами (биоварами) бактерий, имеет важное таксономическое значение для идентификации бактерий. Целый ряд ферментов (гиалуронидаза, коагулаза и других) способствуют проявлению патогенных свойств возбудителей, поскольку субстратом их действия являются вещества, входящие в состав клеток и тканей организма человека.

Одни ферменты локализуются в цитоплазме, цитоплазматической мембране и периплазматическом пространстве бактерий – эндоферменты, другие – экзоферменты, выделяются в окружающую среду. Функциональное значение экзоферментов связано с расщеплением макромолекул в окружающей среде до более простых соединений.

Ферменты могут функционировать независимо друг от друга или быть тесно связанными между собой, обеспечивая протекание метаболических реакций в строгой последовательности. Последние носят название – мультиферментные комплексы (ферменты дыхательной цепи, локализованные на цитоплазматической мембране).

У бактерий различают три основные группы ферментов:

1. Конститутивные – постоянно синтезирующиеся в микробных клетках.

2. Индуцибелъные – синтез которых индуцируется соответствующим субстратом.

3. Репрессибельные – синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Для идентификации микроорганизмов – возбудителей инфекционных болезней, кроме морфологических и культурных свойств, необходимо изучение биохимических признаков, к которым относят: сахаролитические, протеолитические свойства бактерий, пигменто – и токсинообразование.

Бактерии характеризуются неодинаковой способностью использовать различные углеводы. Утилизация углеводов бактериями приводит к образованию органических кислот, либо кислот и газов.

Определение сахаролитических ферментов.

Бактерии ферментируют углеводы с образованием кислоты, а иногда кислоты и газа.

Выявление сахаролитических ферментов проводит на средах Гисса. состоящих из 1% пептонной воды. 0.5% определенного углевода (глюкоза, лактоза, маннит и др.) и индикатора Андреде (кислый фуксин в растворе NаОН). В щелочной среде фуксин обесцвечен. Свежеприготовленная среда имеет соломенно-желтый цвет. В пробирку со средой опускают поплавок (стеклянная трубочка один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов. Результаты посевов учитывают через 2 – 48 часов.

При расщеплении углеводов, вследствие образования кислоты, происходит сдвиг рН в кислую сторону. Цвет среды меняется. Среда Гисса приобретает малиново-красный цвет фуксина. Делают вывод о расщеплении данного углевода до кислоты. Например, глюкоза+ К. При расщеплении углеводов с образованием кислоты и газа отмечают изменение цвета среды и появление пузырька газа в поплавке. Например, лактоза+ К/Г (рисунок 29).

Отдельные бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты – протеазы, катализирующие расщепление белка

О протеолитической активности бактерий судят по способности расщеплять белок до газов: индола и сероводорода. Для этого исследуемую культуру засевают на МПБ. Между пробкой и горлышком пробирки укрепляют индикаторные бумажки. На сероводород – индикаторная бумажка пропитана уксуснокислым свинцом (при выделении Н₂S – чернеет), а на индол – индикаторная бумажка пропитана раствором щавелевой кислоты (при выделении индола – краснеет).

Также для определения протеолитических ферментов – коллагеназ производят посев уколом исследуемой культуры в столбик мясо–пептонной желатины (МПЖ). Продолжительность культивирования 7–10 суток при комнатной температуре. При положительном результате наблюдается разжижение желатины.

Рис. 29 Изучение сахаролитических свойств E.coli на средах Гисса

При микробиологической диагностике дифтерии производят посев выделенной чистой культуры бактерий на среду с мочевиной (для выявления уреазы) и среду с цистином (для обнаружения цистиназы).

При диагностике кишечных инфекций среда Клиглера для выявления ферментации глюкозы, лактозы испособности вырабатывать сероводород.

В настоящее время для изучения биохимических свойств бактерий используют системы индикаторные бумажные (СИБ) или мультимикротесты (ММТ).

СИБ – набор бумажных дисков или полосок, пропитанных различными субстратами и индикаторами. Диски, которые помещают в пробирки со взвесью изучаемой культуры, после инкубирования в термостате по изменению цвета диска, делают вывод о продукции фермента (рисунок 30).

При использования индикаторных полосок с помощью бактериальной петли наносят исследуемую культуру на полоску, при наличии соответствующего фермента наблюдают изменение цвета.

Рис. 30 Системы индикаторные бумажные

ММТ представляют собой пластиковые планшеты, в лунках которых находятся различные субстраты с индикаторами, в которые вносят взвесь изучаемой культуры. После инкубирования в термостате по изменению или содержимого лунок судят о биохимических свойствах культуры (рисунок 31).

В настоящее время используют автоматические биохимические анализаторы (рисунок 32).

Рис. 31 Мультимикротесты Рис. 32. Автоматические биохимические

анализаторы.

Пигментообразование является стойким генетическим признаком микроба и наличие цвета используют для идентификации пигментообразующих бактерий. Для большинства патогенных бактерий пигментообразование не характерно. Белый, золотистый, лимонно-желтый пигмент образуют стафилококки; желтый, кремовый – микобактерии туберкулеза; сине – зеленый – синегнойная палочка.

Пигменты, как правило, защищают микробную клетку от ультрафиолетовой радиации (рисунок 33).

Рис. 33 Пигментированные колонии