Пробирочных растений

Разработка методов микроклонального размножения позволила решить большинство проблем, связанных с поддержанием генетических коллекций растений. Для этого во многих случаях достаточно производить регулярное черенкование пробирочных растений, полученных в культуре меристем. Однако размножение растений и поддержание коллекций in vitro имеют разные цели. Если в первом случае стоит задача за максимально короткие сроки получить как можно больше клонов определенного генотипа, то во втором случае важно просто сохранить с наименьшими затратами жизнеспособность его пробирочных растений. С целью снижения затрат при поддержании коллекций пробирочных растений используют различные методы замедления их роста, что позволяет увеличить промежутки времени между пересадками. Для этого применяют:

- пониженную температуру культивирования;

- пониженное атмосферное давление или снижение концентрации кислорода в воздушной среде, при которой производят культивирование;

- добавление в питательную среду осмотиков или регуляторов роста, замедляющих рост растений;

- получение и хранение при пониженных температурах запасающих органов растений (микроклубней, микролуковиц, микроклубнелуковиц) или инкапсулированных соматических эмбриоидов.

Период без пересадок пробирочных культур можно удлинить до 6-24 и более месяцев путем культивирования пробирочных растений в условиях низких положительных температур (1-10^оС). При этом снижают интенсивность освещения (до 10-50 люкс), оставляя неизменным длительность ежедневного освещения 16 час, или культивирование производят в темноте. Оптимальную температуру подбирают экспериментально: важно добиться максимального замедления роста без существенной утраты жизнеспособности культур. Как правило, более низкие температуры (1-4 ^оС ) применяют для холодостойких культур, клонирование которых проводят при температуре 20-25^оС. Для теплолюбивых культур (клонирование при температуре около 30^оС) замедление роста достигается путем культивирования растений при температуре 8-16 ^оС. С помощью данного метода Mullin, Schlegel (1976) поддерживали без пересадки коллекцию пробирочных растений садовой земляники в течение 6 лет, добавляя в культуры несколько капель свежей питательной среды каждые три месяца.

Снижение роста культур пробирочных растений достигается также благодаря снижению атмосферного давления (до 0,5 мм рт. ст.) и/или модификацией газовой среды путем снижения концентрации кислорода (эти методы позаимствованы из практики сохранения овощей, плодов и срезанных цветов). Для создания гипоксии используют смесь инертного газа (азота) и кислорода в концентрации 1-10%. Важно при понижении атмосферного давления поддерживать высокую влажность, чтобы не происходило быстрое высыхание питательной среды. Этот метод особо перспективен для сохранения коллекций теплолюбивых растений, не пригодных для хранения при пониженных температурах.

Эффективный метод снижения интенсивности роста пробирочных растений –добавление в питательную среду осмотиков и ретардантов. Для создания осмотического стресса, замедляющего рост культур, применяют повышенные концентрации сахарозы в питательной среде (6-10%), добавление в питательную среду 3-6% маннита или сорбита. В качестве ретардантов используют хлорхолинхлорид, гидразид малеиновой кислоты, 2,2-диметил гидразид янтарной кислоты (В-995), Фосфон Д.

Для сохранения коллекций ряда культур представляется перспективным получение микроклубней, микролуковиц, микроклубнелуковиц, инкапсуляция соматических эмбриоидов или отдельных частей растений в альгинатные капсулы и хранение их при пониженных температурах. Так, микроклубни картофеля можно хранить в стерильных пробирках в холодильнике 6-12 мес. После прохождения периода покоя они прорастают, образуя длинные этиолированные ростки. Их можно по завершении хранения удалить, разрезать клубень пополам и поместить на питательную среду, где из спящих почек при культивировании на свету формируются нормальные пробирочные растения, пригодные для размножения или дальнейшего хранения in vitro (Рис 5.6).

Эффективным способом хранения растительного материала (соматических эмбриоидов, пазушных почек, сегментов стебля пробирочных растений, корневых культур) при пониженных температурах (1-4^оС) является инкапсуляция в альгинатные шарики. Инкапсуляция позволяет существенно замедлить рост, транспирацию и, в результате, обеспечивает длительное сохранение жизнеспособности культур. Инкапсуляция в сочетании с дегидратацией растительного материала оказывает положительный эффект на сохранность культур при криоконсервации.