Проблемы перевода растений-регенерантов из условий in vitro в условия ex vitro

Растения, полученные в результате клонального размножения in vitro, формируются в условиях, существенно отличающихся от тех, что имеют место при выращивании их в грунте: высокий уровень неорганического и органического питания, сахароза в качестве источника углеводов, присутствие в среде экзогенных регуляторов роста, высокая влажность, недостаточное освещение и пониженный газообмен. Эти особенности микроклимата весьма благоприятны для быстрого роста и размножения, однако они способствуют появлению у растений структурных и физиологических характеристик, сильно затрудняющих их выживание в условиях ex vitro.

Сформированные при повышенной влажности и гетеротрофном питании листья имеют слабую анатомическую дифференциацию: палисадная ткань отсутствует или слабо развита, мезофилл в основном представлен клетками губчатой паренхимы с большим межклеточным пространством, хлоропласты имеют неорганизованные граны, низкое содержание хлорофилла и протеинов. Ферменты, ответственные за фотосинтез, обладают пониженной активностью. Сосудистая система листьев недоразвита. Многочисленные устьица остаются полностью раскрытыми и не реагируют на стимулы (темнота, CО₂ , абсцизовая кислота и другие), которые в норме вызывают их закрытие. Защитное восковое покрытие практически отсутствует, а тот воск, который образуется, существенно отличается по химическому составу от воска на листьях растений, выращиваемых в окружающей среде (обладает пониженными гидрофобными свойствами). Стебли пробирочных растений недостаточно лигнифицированы, в них значительно меньше колленхимы и склеренхимы по сравнению с нормальными растениями. Клетки имеют тонкие оболочки, а межклеточное пространство увеличено, сосудистая система недоразвита. У многих растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков.

Приведенные особенности анатомии и физиологии пробирочных растений создают значительные трудности в их адаптации к условиям окружающей среды при переносе в условия ex vitro. Нередко после пересадки в грунт наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений, прежде всего, из-за нарушения водного баланса. Для уменьшения потерь разработан ряд методических приемов, позволяющих улучшить приживаемость растений. Часть из них применяют в условиях in vitro, а остальные – после высадки растений в грунт.

Последний, перед высадкой растений, пассаж рекомендуют производить на более бедную по составу минеральных солей питательную среду, например, среду Уайта, концентрацию сахарозы уменьшают до 1%. Из среды полностью исключают цитокинины, оставляя только ауксины, стимулирующие корнеобразование (например, ИМК). Предлагается повысить интенсивность освещения (до 8-10 тыс. люкс) и немного понизить, по сравнению с обычной, температуру, при которой производят культивирование. Эффективной является добавка в питательную среду ретардантов роста, а также адаптогенов типа янтарной кислоты, крезацина, Мивала-Агро, которые ингибируют рост стеблей в длину, вызывают утолщение корней, уменьшают листовую поверхность, увеличивают содержание хлорофилла и стимулируют образование воска на листьях. Аналогичный эффект дает снижение влажности воздуха в культуральных сосудах путем использования десикантов, охлаждения нижней части сосудов, а также простым удалением пробок из пробирок за 7-10 дней до высадки растений в грунт. Для ряда древесных культур благоприятный эффект дает микоризация пробирочных растений.

Высадку пробирочных растений в грунт обычно производят весной или в начале лета. Используют теплицы или комнаты с регулируемым режимом освещения, температуры, влажности. Чтобы уменьшить гибель растений из-за обезвоживания, после высадки их в грунт поддерживают высокую влажность воздуха с помощью туманообразующих установок, накрывают посадки неткаными материалами. Представляет интерес применение способа уменьшения испарения воды листьями, предложенного индийскими учеными. Он включает опрыскивание растений в течение адаптационного периода 50% водным раствором глицерина, или смесью (1:1) парафина и диэтилового эфира.

В качестве грунта для высадки пробирочных растений используют нейтрализованный и обогащенный минеральными солями верховой торф, смесь торфа и песка (3:1), перлит. Хорошие результаты получены при использовании субстратов на основе ионообменных смол, разработанных в Институте физико-органической химии НАН Беларуси. Однако такие субстраты весьма дорогостоящи, что ограничивает их широкомасштабное применение. Укоренившиеся в грунте растения, после того, как они тронулись в рост, подкармливают комплексными удобрениями, проводят обработки против болезней и вредителей. После завершения периода адаптации (через 20-30 дней) их пересаживают на постоянное место в теплице или в поле.

Проблемы высадки пробирочных растений в грунт связаны не только с адаптацией к условиям выращивания, но также со сложностью и трудоемкостью самой процедуры, невозможностью ее механизации. В условиях промышленного производства стоит задача в короткие сроки высадить в грунт огромное количество пробирочных растений (до 100 тысяч и более). Вместе с тем растения, чтобы не повредить, необходимо извлекать из пробирок и высаживать в грунт с осторожностью. В решении обоих этих проблем большие перспективы связывают с использованием сформированных in vitro запасающих органов растений: клубней, луковиц, клубнелуковиц (в русскоязычной литературе их называют микроклубнями, микролуковицами, микроклубнелуковицами), а также искусственных семян (инкапсулированных соматических эмбриоидов). Их проще не только высаживать в грунт без всякой адаптации, но и хранить, транспортировать.

Микролуковицы образуются при индукции адвентивных стеблевых почек из сегментов чешуй или донца луковичных растений (Рис. 5.4). Так, разделив чешую луковицы лилии на небольшие сегменты, можно за 35-40 дней получить до 100 микролуковиц.

Микроклубни способны образовывать при определенных условиях культивирования пробирочные растения картофеля (Рис. 5.5). Спонтанное образование микроклубней происходит, если растение картофеля оставить на питательной среде до ее подсыхания. Чтобы активировать этот процесс, используют питательную среду с цитокининами (3-5 мг/л 6-БАП) и повышенным содержанием сахарозы (6-10%). Эффективным может быть добавление в питательную среду ретардантов (500 мг/л хлорхолинхлорида). Пониженные температуры (15-18^оС), сокращение светового периода до 10 час или перенос культур в темноту также способствуют клубнеобразованию. Как микроклубни, так и микролуковицы можно получать на жидкой питательной среде в биореакторах, что позволяет уменьшить стоимость их производства. Разные сорта картофеля образуют микроклубни in vitro с различной интенсивность. Для некоторых сортов эта технология не подходит, так как лишь небольшой процент пробирочных растений способно формировать клубни даже в оптимальных условиях. Поэтому способность к образованию микроклубней необходимо оценивать для каждого конкретного сорта и применять эту технологию только к тем из них, которые обеспечивают высокий выход продукции.

Полученные в пробирках микроклубни по своей физиологии во многом напоминают клубни от выращиваемых в грунте растений. В частности, для них характерен продолжительный (3-4 месяца, в зависимости от сорта) период покоя. Это весьма полезный признак для сохранения генетических коллекций картофеля. Однако при использовании метода для целей клонального размножения он создает некоторые неудобства, так как сокращает период микроклонирования пробирочных растений: микроклубни должны быть собраны за три месяца до посадки в грунт, чтобы могли пройти период покоя. В связи с этим оптимальным представляется сочетание двух методов микроразмножения картофеля: в начальный период растения размножают однопочковыми стеблевыми черенками (путем индукции пазушных меристем), затем часть полученных пробирочных растений переносят в условия, благоприятные для образования микроклубней, а вторую часть продолжают размножать черенкованием. В результате в грунт высаживают как традиционные пробирочные растения, так и микроклубни, прошедшие период покоя, что позволяет уменьшить трудозатраты.

В Институте генетики и цитологии НАН Беларуси разработана схема производства микроклубней картофеля, которая обеспечивает ритмичность работ и позволяет рационально использовать оборудование и персонал (Ермишин, 1994). Схема включает три питомника определенного объема: питомник 1 – маточных растений (для черенкования); питомник 2 – «подроста» (здесь из черенков формируются растения, которые затем переносят в условия, оптимальные для образования микроклубней (питомник 3). Важнейшая особенность технологии, которая обеспечивает ритмичность работ – порядок черенкования маточных растений и заполнения питомников. За рабочий день их должно быть расчеренковано ровно столько, чтобы, с одной стороны, выполнялся график заполнения питомника 2, с другой – полностью возобновлялся объем питомника 1, который должен быть постоянным.

Динамика заполнения питомников показана на Рис. 5.6. Производственный цикл начинают, имея в питомнике 1 определенное число пробирочных растений. Формула для расчета его объема имеет следующий вид:

А= Rt/W(b-1), (1)

где А – объем питомника 1; R - количество микроклубней, которое надо произвести (план); W – общее количество запланированных рабочих дней, в которые производят черенкование; b – количество черенков с одного маточного растения; t – количество рабочих дней в период времени, необходимом для получения растения, пригодного для черенкования (то есть способного давать b черенков). Величины b и t определяют опытным путем для каждого конкретного сорта, условий культивирования маточных растений и организации производственного процесса.

Для определения необходимого для реализации плана количества светоустановок, размеров производственных площадей требуются сведения о максимальном объеме питомника 2. Его находят по формуле:

F= Rе/W, (2)

где F – объем питомника 2; е – количество рабочих дней в течение периода нахождения пробирочных растений в питомнике 2; W – общее количество запланированных рабочих дней.

Таким образом, если ставится задача произвести R=30 тыс. микроклубней за W=50 дней при условии, что от каждого маточного растения получают b=4 черенка, а на период времени, за которое вырастает готовое к черенкованию пробирочное растение, приходится t=15 рабочих дней, то в начале производственного цикла в питомнике 1 должно быть 3 тыс. маточных растений. При максимальном заполнении питомника 2 его объем составит 9 тыс. растений.

При производстве 30 тыс. микроклубней по традиционной технологии (сначала путем черенкования получают нужное количество растений, затем их переносят в условия, оптимальные для образования микроклубней), потребовалось бы помещение, оборудованное светоустановками на 30 тыс. пробирок (1 микроклубень с одного пробирочного растения). В нашем же примере достаточно установок на 12 тыс. пробирок (3 тыс. – питомник 1 и 9 тыс. – питомник 2), то есть в 2,5 раза меньше.

В начале производственного цикла по традиционной технологии объемы черенкования небольшие. В завершение же цикла за короткое время должно быть расчеренковано 7,5 тыс. растений (30 тыс. : 4), что очень много, если учесть, что в среднем за рабочий день один сотрудник черенкует 150-200 растений. Предлагаемая технология полностью решает проблему: нагрузка распределена равномерно по всему циклу, дневная выработка стабильна и относительно невелика.