Методы клонального размножения растений in vitro

На практике используют следующие методы микроразмножения:

- активация развития уже существующих меристем (апекса стебля, пазушных и спящих почек стебля);

- индукция адвентивных почек у эксплантата или в каллюсной культуре;

- соматический эмбриогенез.

Активация развития уже существующих в растении меристем основана на снятии апикального доминирования. Апикальное доминирование– подавление роста боковых почек растительного побега при наличии верхушечной почки. Снять его у пробирочных растений можно двумя путями: удалением верхушечной почки или добавлением в питательную среду цитокининов.

Первый из этих методов предполагает разделение пробирочных растений на черенки, содержащие, как правило, одну пазушную меристему. Черенки высаживают на питательную среду, удалив полностью или частично листовую пластинку. Через некоторое время пазушная меристема активируется, образуется один или несколько проростков. Одновременно происходит укоренение черенка. В результате за сравнительно короткое время (при размножении картофеля – через 3-4 недели) получается пробирочное растение, которое можно черенковать и начинать новый цикл клонирования (Рис. 5.1). Один из черенков при таком размножении содержит не пазушную, а терминальную почку. Она также активируется при посадке черенка на питательную среду и за те же сроки формирует пробирочное растение.

В случае использования цитокининов для снятия апикального доминирования развитие пазушных почек возможно без удаления верхушечной почки. При этом из почек эксплантата и побегов, тронувшихся в рост из верхушечной и пазушных почек эксплантата, формируется конгломерат побегов (аксиллярное ветвление) (Рис. 5.2). Когда они достигнут определенной длины (1-2 см), их отделяют от эксплантата и переносят на свежую питательную среду, содержащую цитокинины для следующего цикла размножения, или на среду с ауксинами (в некоторых случаях без регуляторов роста) для укоренения и последующей высадки в грунт. При размножении некоторых культур, прежде всего, древесных и кустарниковых, подросшие побеги укореняют ex vitro, применяя для этого специальные субстраты. Это позволяет уменьшить стоимость продукции.

Микроразмножение путем активации меристем является наиболее эффективным методом размножения растений. По сравнению с другими методами он в наибольшей степени обеспечивает сохранение генотипа исходного маточного растения, так как полученные клоны происходят непосредственно из меристематических клеток, для которых характерна высокая цитогенетическая стабильность.

На основе этого метода разработаны и применяются на практике технологии размножения овощных и технических культур (картофель, томаты, огурец, перец, тыква, спаржа, сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис, и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.), древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.), культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.).

Метод клонального размножения растений in vitro путем индукции адвентивных почек основан на свойстве тотипотентности растительной клетки. Суть его заключается в том, что эксплантаты разных частей и органов растений, не содержащие стеблевых почек, способны их образовывать in vitro при наличии факторов, индуцирующих стеблевой органогенез. В качестве эксплантатов могут быть сегменты листовых пластинок и черешков, молодых соцветий, чешуй и донца луковиц, клубнелуковиц, корневые черенки, боковые и интеркалярные меристемы и другие органы и ткани. Стеблевые почки возникают de novo как в эпидермальных, так и супэпидермальных слоях эксплантата. Поскольку они появляются в «необычном» для растения месте, их называют адвентивными (добавочными).

Имеется ряд растений, для которых формирование адвентивных почек – естественный способ вегетативного размножения. Например, малина и ежевика размножаются стеблевыми почками, возникающими на корнях. Бегонию, узамбарские фиалки (сенполии) и некоторые другие декоративные растения размножают преимущественно листовыми черенками. В культуре in vitro благодаря использованию соответствующих регуляторов роста (см. гл. 3) этот процесс можно значительно интенсифицировать, более того, добиться массового образования адвентивных почек у растений, которые в условиях in vivo их практически не образуют.

Индукция адвентивных почек из тканей эксплантата - наиболее распространенный метод микроразмножения луковичных цветочных растений (лилий, нарциссов, гиацинтов, тюльпанов) – из луковичных чешуй, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантатов листьев; земляники садовой – из основания побегов, регенерированных в культуре меристем; представителей рода Brassica (капусты цветной, кочанной, брюссельской, брокколи) – из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; салата цикорного – из сегментов листовых пластинок; петуний – из сегментов корней; глоксиний, сенполий, стрептокарпуса, эхинапсуса – из сегментов листовых пластинок.

Полученные с помощью данного метода растения-регенеранты не всегда в полной мере воспроизводят генотип исходного маточного растения, так как цитогенетическая стабильность клеток специализированных тканей не такая высокая, как у клеток меристемных тканей. Длительно размножаемые вегетативным способом растения могут накапливать соматические мутации, в результате чего они становятся химерными. Некоторые декоративные пестролистные растения являются генетическими химерами. Образование адвентивных почек из измененных клеток приводит к образованию генетически отличных растений-регенерантов. Тем не менее, опыт показывает, что при использовании этого метода размножения в большинстве случаев вариация растений-регенерантов не выходит за рамки естественного уровня.

Адвентивные стеблевые почки могут образовываться и в каллюсной культуре in vitro (стеблевой органогенез). Быстро растущие каллюсные культуры, сохраняющие высокую способность к органогенезу, дают дополнительные возможности для ускорения микроразмножения. Однако генетическая нестабильность каллюсных клеток может приводить к получению растений-регенерантов, имеющих существенные генетические отличия от исходного маточного растения (сомаклональная изменчивость). Такие растения могут представлять селекционный интерес, но для размножения растений в коммерческих целях изменчивость – это весьма существенный недостаток. Тем не менее, данный метод имеет право на жизнь в отдельных случаях, когда другие методы не эффективны, или для культур с невысокой сомаклональной изменчивостью (амариллис, эписции, драцены, томаты, спаржа, некоторые древесные породы).

Все сказанное относится и к методу клонального размножения растений in vitro, основанному на индукции соматического эмбриогенеза из тканей эксплантата или каллюсных клеток в суспензионной культуре. Вместе с тем некоторые положительные характеристики метода выводят его в число наиболее перспективных. Технологии массового получения соматических эмбриоидов и их адаптации к условиям ex vitro разработаны для ряда важных культур. Эти технологии включают, среди прочего, возможность использования биореакторов (см. главу 4) и механизированное производство искусственных семян путем инкапсуляции эмбриоидов, благодаря чему появляется возможность существенно уменьшить трудозатраты (как при размножении, так и переносе растений в условия ex vitro) и стоимость продукции.

Идею инкапсуляции соматических эмбриоидов с целью получения искусственных семян высказывал Т. Мурасиге еще в 1970-е годы. Она была реализована на практике в начале 1980-х: применительно к высушенным соматическим эмбриоидам моркови (Kitto, Janik, 1982) и влажным (не подвергавшимся подсушиванию) эмбриоидам люцерны (Redenbaugh et al., 1984). Наибольшее распространение получила вторая из названных технологий, которая заключается в инкапсуляции соматических эмбриоидов в различные гелеобразные субстратанции на основе агара, альгината, карбоксиметилцеллюлозы, каррагинана, гельрита, пектата натрия и других. Лучшие результаты были достигнуты при использовании альгината.

Альгиновая кислота представляет собой природный полисахарид из волокон водорослей, состоящий из двух мономеров: маннуроновой и гиалуроновой кислот (в разных соотношениях). Длинные цепи этих кислот могут перекрестно сшиваться в трехмерные цепи, которые своими карбоксильными группами связывают ионы двухвалентных металлов. Натриевая соль альгиновой кислоты хорошо растворима в воде, образуя вязкие растворы, благодаря чему ее используют в пищевой промышленности в качестве загустителя и стабилизатора. Для получения искусственных семян альгинат натрия растворяют в питательной среде, в которой выращивались соматические эмбриоиды, и в отдельные капли этого раствора помещают по одному эмбриоиду с помощью специальных приспособлений, оборудованных пипетками. Капли альгината с эмбриоидом внутри образуют в растворе нитрата кальция (или хлористого кальция) круглые плотные капсулы в результате замещения ионов Na⁺ на ионы Ca²⁺. Плотность капсул зависит от количества замещенных ионов (обычно коплексование производят с 1-5% раствором альгината натрия в 100 мМ растворе нитрата кальция в течение 20-30 минут, после чего капсулы промывают водой или питательной средой) (Рис. 5.3).

Соматические эмбриоиды в отличие от зиготических зародышей не содержат эндосперма. Чтобы восполнить данный недостаток, все необходимые питательные вещества добавляют в матрикс капсулы. Это обеспечивает жизнеспособность эмбриоида в течение сравнительно длительного времени (6 месяцев и более) при хранении при 4^oC, а также способность к прорастанию при высеве капсул в грунт. Кроме того, в матрикс вводят фунгициды, пестициды, антибиотики, повышающие сохранность капсул, активированный уголь, который улучшает дыхание эмбриоидов. В отдельных случаях (при инкапсуляции семян некоторых орхидей) туда вводят микоризы, необходимые для успешного прорастания семян и развития проростков.

Для улучшения качества искусственных семян проводят синхронизацию развития эмбриоидов (с помощью фильтрации через сита разного размера, центрифугирования, автоматического сепарирования), практикуют специальный режим подращивания эмбриоидов перед инкапсуляцией (Onishi et al., 1994). Этот режим включает подращивание эмбриоидов в жидкой питательной среде с добавлением осмотика (10% маннитола) на свету (около 300 люкс, фотопериод 16 час). За это время их размер увеличивается в 3-4 раза, возрастает содержание хлорофилла. Затем их подсушивают в течение недели на фильтровальной бумаге и на свету (содержание воды в них снижается до 80-90%), после чего культивируют на питательной среде с 2% сорбитола, 0,01 мг/л 6-БАП и 0,01 мг/л ГК-3 при повышенной концентрации углекислого газа в воздухе (2%) в течение двух недель, в течение которых эмбриоиды переходят на автотрофное питание. Инкапсулированные эмбриоиды, подготовленные описанным способом, имеют высокую для искусственных семян всхожесть – около 50%.

В целом, именно низкая всхожесть искусственных семян является основным сдерживающим фактором их широкого использования. Существенным недостатком метода является также возможная сомаклональная изменчивость полученных растений. Тем не менее, эту технологию применяют для размножения ряда ценных культур: орхидей (дендробиумов, цимбидиумов, фаленопсисов, спатоглоссисов), известного индийского лекарственного растения нима (Azaridirachta indica), сандалового дерева (Santalum album), люцерны, хлопчатника. Для размножения же масличной пальмы (Elaeis guineensis) индукция соматического эмбриогенеза является единственным приемлемым методом вегетативного размножения.