Тема 3: ГЕНОМЫ ЭУКАРИОТ

Геном эукариот более сложен, чем у прокариот и включает нуклеотидные последовательности хромосом, ДНК митохондрий и пластид (1-10 % от общего генома, у дрожжей до 20%), ДНК плазмид у дрожжей, ДНК латентных и дефектных вирусов.

Ядро эукариот хорошо выражено, имеется ядерная мембрана, окружающая хромосомы. Хромосом много, они парные, состоят из гомологичных хроматид, каждая из которых представляет двухцепочечную молекулу ДНК (набор хромосом диплоидный). В составе хромосомы – 50 % ДНК и 50 % белков, которые представлены основными гистоновыми белками, входящими в состав нуклеосом, и кислыми белками, которые заполняют полость нуклеосом, разрыхляют ее и играют важную роль в распаде нуклеосом перед началом транскрипции и репликации.

В релаксированном состоянии хромосомы эукариот могут достигать нескольких сантиметров (у человека до 5 см в длину). Существуют несколько стадий конденсации хромосом, в результате чего хромосома компактизируется, накручивается на нуклеосомы и образует более сложные свернутые структуры.

Стадии компактизации (конденсации) хромосом. Акты конденсации и деконденсации хромосом сменяют друг друга в клеточном цикле: в интерфазе ДНК выглядит в виде вытянутых спутанных нитей и получила название - хроматин. В этом состоянии ДНК частично релаксирована, что облегчает прохождение процесса транскрипции и репликации. Для расхождения (сегрегации) хромосом в митозе очень важно, чтобы хромосомы были суперспирализованы – конденсированы. Для этого в начале профазы митоза ДНК начинает компактизоваться с помощью положительной и отрицательной суперспирализации, а также путем накручивания на нуклеосомы. Нуклеосомная нить ДНК напоминает бусы, в которых нить (суперспирализованная молекула ДНК) намотана на бусинки (нуклеосомы).

Рис. 3.1. Cтадии компактизации хроматина

Нуклеосома – октомер из 8 субъединиц белков-гистонов, включающая по 2 молекулы гистонов Н2А, Н2В, Н3, Н4. Диаметр нуклеосомы - 11 нм, высота - 5,7 нм. По краям от нуклеосом имеются свободные участки ДНК в 20-90 пар нуклеотидов – линкеры. Гистон Н1 не входит в состав нуклеосомы, а фиксирует петли линкеров, удерживая ДНК на нуклеосоме. Такое нуклеосомное строение хромосом характерно только для линейных хромосом эукариот.

В результате спирализации и накручивания на нуклеосомы хромосомы укорачиваются и превращаются в метафазные хромосомы (стадия метафазы), сокращаясь в длину в 10000 раз, а в диаметре – примерно в 700 раз. Это способствует нормальному расхождению (сегрегации) хромосом в анафазе митоза. Рентгеноструктурный анализ позволил выявить следующие стадии компактизации ДНК.

1-ая стадия - двухцепочечная спираль ДНК (диаметр – 2 нм), обычно в правозакрученной В-форме.

2-ая стадия – нуклеосомная нить (диаметр – 11нм). ДНК наматывается на частички нуклеосом, образуя на них 1,75 витка (146 пар нуклеотидов).

3-ая стадия – образование хроматиновой фибриллы (диаметр 30 нм). Нуклеосомы сближаются друг с другом, образуется зигзагообразная «лента», которая скручивается в соленоид– спираль с полостью внутри.

4-ая стадия – образование петлевых доменов (диаметр 300 нм) формируется путем формирования петель из нити соленоида.

5-ая стадия – образование метафазных хромосом, которые получили название «ламповых щеток» (диаметр 1400 нм).

Избыточность геномов эукариот.Только незначительная часть ДНК у эукариот представлена структурными и регуляторными генами, остальная часть генома представляет собой «эгоистичную» (сателлитную) ДНК, которая очевидно попала в геном эукариот путём интеграции вирусов и других мобильных генетических элементов. В геноме человека насчитывается 3,5 х 10⁹ пар нуклеотидов. Геномы млекопитающих различаются, но имеют близкие значения молекулярной массы хромосом, достигающие сотен миллиардов Да. В соответствии с величиной генома у человека должно бы было быть 150000 и более генов, однако в 2003 г. американские ученые заявили о существовании 30000 генов, в последние годы предполагается наличие 75 тыс. генов, остальная часть геномной ДНК очевидно является “генетическим мусором”. Значительная часть генома представлена некодирующими последовательностями. У человека некодирующие последовательности составляют 80-85% (по другим данным – 92%), а у растений – до 90% и более, т.е. характерна избыточность генома.

В геноме эукариот выделяют следующие типы последовательностей ДНК:

1)многократно повторяющиеся последовательности, которых насчитывается более 10⁵ повторов на геном. Чаще всего это блоки из 5-8 нуклеотидов, которые тандемно повторяются и образуют фрагменты в 150-500 пар нуклеотидов, например - (ААТАТ)30-100. Функция их до конца неизвестна, но предполагают, что они могут играть роль в регуляции работы генов – находятся в области центромер, теломер, интронов, транспозонов. Это последовательности: Alu, B1 , B2, L1. Среди многократно повторяющихся последовательностей очень часто встречаются сайты рестрикции в составе палиндромов (см. дальше - тема «Репарации»). Сайты рестрикции могут быть теми горячими точками, куда встраиваются плазмиды, транспозоны, вирусные ДНК, трансгены.

2) умеренно повторяющиеся последовательности – встречаются на геном от 10 до10⁵. К ним относятся последовательности, кодирующие гистоны, рибосомальные белки, р-РНК и т-РНК, IS-элементы, вставочные последовательности.

3) мультигенные семейства– это группы близких по структуре и функциям генов, которые «включаются» на разных этапах онтогенеза. Например b-цепь гемоглобина кодируется 7 генами, 2 из которых дефектные (псевдогены), остальные 5 включаются последовательно на разных этапах развития: в раннем эмбриогенезе, в плодном периоде (8-9 недель), в детском, юношеском и зрелом возрасте.

4) уникальные гены - специфические гены, которые кодируют синтез структурных и ферментных белков.

Структура генов эукариот.Гены эукариот имеют регуляторные элементы подобные прокариотам - промоторную и терминаторную зоны, между которыми располагается последовательность ДНК, непосредственно кодирующая белок. Регуляторные элементы генов очень важны, поскольку именно благодаря им гены «включаются» только тогда, когда есть необходимость в соответствующих белковых продуктах. Промоторная зона обеспечивает начало транскрипции и трансляции, а терминаторная зона – конец этих процессов.

В промоторах можна выделить следующие консервативные последовательности: ГЦ-мотив, ЦААТ, ТАТА, АГГАГ, инициирующий кодон АТГ (АУГ на РНК). Далее идет структурная часть гена, которая состоит из экзонов и интронов. За структурной частью гена следует зона терминатора, представленная терминирующим кодоном ТТА (ТАГ или ТГА) и терминатором. На рис. 3.1. представлены основные участки гена эукариот.

Рис. 3.2. Тонкая структура гена эукариот

Обозначения и пояснения к рис. 3.2.

Функции основных регуляторных элементов гена

· ГЦ-мотив –один из наиболее часто встречающихся регуляторных элементов гена. Представлен палиндромом ГГЦГГГ / ЦЦЦГЦЦ, встречается в генах общих функций, то есть тех, которые экспрессируются во всех клетках организма и играют важную роль в их жизнеобеспечении. Этот участок является, очевидно, оператором транскрипции. Присоединение к ГЦ-мотиву белка-регулятора SP1, увеличивает транскрипцию в 10-20 раз.

· ЦААТ – участок промотора гена, который, по всей видимости, распознается РНК- полимеразой перед началом транскрипции. Очевидно, этот участок выполняет ту же функцию, что у прокариот ТТГАЦА (блок Гилберта). ЦЦААТ встречается в тканеспецифичных генах, то есть тех, которые экспрессируются только в некоторых тканях и органах. Так, ген инсулина включается в основном только в клетках островков Лангерганса поджелудочной железы, ген альфа-фетопротеина - у взрослого человека только в клетках печени.

· блок Хогнеса - ТАТА (ТАТАААА или ТАТААТА), подобен блоку Прибнова (ТАТААТ) у прокариот, служит для присоединения РНК-полимеразы к ДНК в промоторной зоне, его положение в гене относительно нулевой точки начала транскрипции – (-30).

· центр связывания с рибосомойсодержит редуцированную последовательность Шайна-Дальгарно АГГАГ (см. функции последовательности Шайна-Дальгарно АГГАГГ у прокариот, тема «Геномы прокариот»).

· инициирующий кодон представлен триплетом АТГ (АУГ – на РНК), транскрибируется в составе информационной РНК, с него начинается трансляция. При синтезе полипептида на рибосоме этому кодону соответствует аминокислота метионин. С метионина начинается синтез большинства белков.

· структурная часть гена – это последовательность ДНК, которая непосредственно кодирует сам белок. У эукариот, в отличие от прокариот, она не цельная, а состоит из экзонов (кодирующих участков) и интронов (вставочных некодирующих участков).

· терминирующий кодон - участок, который транскрибируется на и-РНК и обеспечивает окончание трансляции на рибосомах. На ДНК представлен нонсенс-кодонами - триплетами ТАА, ТАГ, ТГА, на РНК им соответствуют УАА, УАГ и УГА. Этим триплетам не соответствует ни одна из аминокислот, поэтому на них в рибосоме обрывается синтез полипептида.

· терминаторный участок очевидно представлен в каждом гене специфической нуклеотидной последовательностью.

В геноме эукариот обнаружили также специфические регуляторные последовательности, которые могут выступать в роли энхансеров– усилителей транскрипции, а также последовательности, которые выступают в роли сайленсеров – глушителей транскрипции. Они могут находиться на значительном удалении от гена, который регулируют, причем, одни и те же последовательности в одной клетке могут быть энхансерами, а в другой - сайленсерами. С их помощью регулируется экспрессия генов.

Обнаружены также регуляторные белки, способные связываться с промоторной зоной гена и обеспечивающие либо активацию, либо подавление транскрипции. Так, регуляторный белок SP1, связываясь с ГЦ-мотивом, может усиливать транскрипцию в 10-20 раз.

Устройство генов эукариот. Гены эукариотических организмов обладают следующими характеристиками:

- одиночные, т.е. в отличие от прокариот, не собраны в опероны;

- иногда олигомерные (представлены генами-кластерами);

- прерывистые, т.е. разделены на интроны и экзоны;

- перекрывающиеся, т.е. в пределах одного генного участка ДНК может функционировать несколько рамок считывания.

Генетический анализ у эукариот, в частности у их простейших представителей – дрожжей и нейроспоры, показал, что гены, контролирующие различные этапы одного и того же пути метаболизма, как правило, хаотично разбросаны по геному и обычно не образуют скоплений подобно оперонам бактерий. Однако было найдено несколько исключений, а именно: компактный участок ДНК у грибов контролирует 3 реакции в биосинтезе гистидина. Сходная ситуация обнаружена при изучении генетического контроля биосинтеза ароматических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина), а также – жирных кислот. У исследователей создалось впечатление, что они имеют дело с опероноподобной структурой, кодирующей мультиэнзимный комплекс. В действительности же оказалось (при использовании мутационного анализа), что у грибов все 5 этапов биосинтеза ароматических аминокислот контролирует 1 ген, продуктом которого является длинная полипептидная цепь массой 150 000 Д. Это не оперон, а ген-кластер (cluster-gene). Такие гены-кластеры довольно часто встречаются у эукариот. В качестве примеров можно привести следующие гены-кластеры:

· his 4 – ген-кластер для биосинтеза гистидина у дрожжей-сахаромицетов, кодирует единый полипептид с тремя ферментативными активностями;

· arom 1 – ген-кластер для биосинтеза ароматических аминокислот у нейроспоры, кодирует единый полипептид с пятью ферментативными активностями;

· fas 1 – первый ген-кластер для биосинтеза жирных кислот у дрожжей-сахаромицетов, кодирует полипептид с тремя ферментативными активностями

· fas 2 – второй ген-кластер для биосинтеза жирных кислот у дрожжей-сахаромицетов, кодирует единый полипептид с пятью ферментативными активностями.

Существование генов-кластеров является примером молекулярной олигомеризации. Очевидно, считывание с гена-кластера информации сразу о нескольких ферментах метаболического пути является для клетки “экономически” более выгодным, как и в оперонах прокариот. В отличие от оперона бактерий, в генах-кластерах в результате транскрипци и последующей трансляции на рибосомах синтезируется одна длинная молекула полипептида, в которой отдельные домены после пространственной укладки в третичную структуру начинают выполнять функции отдельных ферментов. В оперонах прокариот отдельные гены оперона обычно транслируются в самостоятельные белковые продукты.

Большинство же генов эукариот – одиночные, т. е в ходе эволюции эукариот происходила автономизация генов. По-видимому, это создает благоприятные условия для раздельной, а значит, и более тонкой регуляции функций отдельных генов. Напомним, что у прокариот регуляции зачастую подвержены сразу все гены оперона, за исключением аутогенного котроля, когда ген-регулятор находится среди структурных генов внутри оперона и позволяет регулировать оперон отдельными блоками.

Гены эукариот прерывистые, а именно, состоят из кодирующих участков – экзонов, и не кодирующих – интронов. Такую структуру генов называют интрон-экзонной или мозаичной структурой.Длина экзонов достигает 1000 пар нуклеотидов, а интронов – обычно 5000-20000 пар нуклеотидов. Структурная часть гена может включать 2-3 (иногда более) экзонов, разделенных длинными интронами. И хотя интронов обычно бывает немного, число их у разных видов и в разных генах может колебаться от 0 (в генах гистонов) до 51 (в структурном гене коллагена). Экзонов всегда больше, чем интронов, но на долю интронов приходится в 5-7 раз больше нуклеотидных пар, чем на долю экзонов, поскольку интроны длиннее. В зависимости от количества экзонов и интронов, а также от их длины зависит длина гена эукариот. У разных организмов она может сильно варьировать. Так, у дрозофилы средняя длина гена составляет 2 тис. п. н., а длина гена фиброина шелка у шелковичного червя достигает 16 тис. п.н.

Существование интронов в структурной части гена создает определенные трудности для реализации генетической информации, так как в транскрибируемой и-РНК оказываются «лишние» участки ДНК, которые впоследствии не должны транслироваться на рибосомах. Как же в клетке эукариот решается эта проблема? Решение было найдено американским ученым Филиппом Шарпом из Массачусетского технологического института, который открыл явление сплайсинга (от англ. to splace – сшивать без узлов).

Механизм сплайсинга. Сначала в ядре с участка хромосомы (гена) транскрибируется полностью последовательность ДНК с формированием про-и-РНК – незрелой, более длинной РНК, которая содержит как экзоны, так и интроны. Далее, когда про-и-РНК направляется из ядра в цитоплазму, при прохождении ядерной мембраны происходит сплайсинг -созревание про-и-РНК, в результате которого вырезаются интроны, а экзоны сшиваются между собой с помощью фермента, получившего название матураза. Для осуществления сплайсинга важную роль играют особые sРНК (длиной до 160 нуклеотидов), которые стягивают между собой концы интронов, что способствует их вырезанию и последующему сшиванию экзонов. В цитоплазму на рибосомы для трансляции поступает уже зрелая и-РНК, в которой нет интронов.

Интроны не всегда являются некодирующими участками. Так, у дрожжей в генах митохондрий обнаружены интроны, кодирующие синтез фермента матуразы, который участвует в вырезании интронов. В некоторых генах дрожжей обнаружены интроны, кодирующие цитохром В и т.д.

Сплайсинг осуществляется белковыми комплексами, получившими название сплайсосомы. В состав сплайсосом, помимо уже названных матураз и sРНК, входят еще белки, придающие про-и-РНК нужную конформацию. Кроме того, сплайсосома связана с ферментами, осуществляющими полиаденилирование 3^/-конца и-РНК.

Типы сплайсинга: простой; альтернативный; транссплайсинг; аутосплайсинг.

Простой сплайсингхарактерендля простых генов, последовательность экзонов которых предназначена для синтеза только одного белка. В таких генах экзоны занимают на ДНК всегда фиксированное положение и удаление интронов всегда ведется в четко обозначенных точках.

Альтернативный сплайсингхарактерен для генных участков, на которых закодированы сразу несколько белков. При этом одни и те же участки выступают то экзонами, то интронами. Так на одном участке ДНК кодируется нейропептид гипофиза и гормон паращитовидной железы. В зависимости от вырезания тех или иных участков ДНК образуется и-РНК, кодирующая тот или иной белок. Альтернативный сплайсинг имеет место при синтезе иммуноглобулинов (антител) и при синтезе антигенов тканевой совместимости (МНС).

Транссплайсинг происходит, если в одну молекулу и-РНК объединяются экзоны из разных генов. Характерен для синтеза компонентов цитоскелета клетки.

Аутосплайсинг обнаружен впервые в макронуклеусе инфузорий, а позже у бактерий, дрозофил и других эукариот. Аутосплайсинг – самонарезание про-и-РНК без участия матураз и других ферментов. РНК, которая сама вырезает из себя интроны, получила название рибозим. Аутосплайсинг свидетельствует о том, что первой молекулой, несущей генетическую информацию, в эволюции была РНК. Она выполняла и генетическую и каталитическую функции, переданные позднее ДНК и белкам соответственно.

Как же в структуре генов образовались некодирующие интроны? Существует гипотеза, что еще на заре эволюции эукариот, они заражались вирусами и за счет интеграции в геном вирусной ДНК в хромосомах появилась избыточная сателлитная (эгоистическая) ДНК. Она присутствует не только в интронных последовательностях генов, но и разбросана по всей длине хромосом в виде огромных вставок некодирующих последовательностей.

У эукариот, так же как и у вирусов, встречаются перекрывающиеся гены, а именно на одном и том же участке ДНК с разных точек (и/или на разных цепях) может начинаться транскрипция с образованием разных и-РНК, кодирующих разные полипептиды.

Репликация у эукариот множественная, в каждой хромосоме существует 20-100 сайтов начала репликации и соответствующее число репликонов. Репликация в них может идти не одномоментно, однако деление клетки не начинается, пока не реплицированы все хромосомы на всем их протяжении. Подробно репликация рассмотрена в отдельной лекции (см. выше).

Транскрипция и трансляцияу эукариот разобщены из-за наличия ядерной мембраны, а именно, транскрипция осуществляется в ядре, а образующаяся при этом информационная РНК должна транспортироваться из ядра в цитоплазму для последующего синтеза белка (трансляции) на рибосомах. Уже говорилось о том, что при преодолении ядерной мембраны происходит сплайсинг, т.е. созревание и-РНК. На все эти процессы необходимо время, поэтому от момента инициации транскрипции до появления белкового продукта в процессе трансляции проходит 6-24 часа. Для сравнения: у прокариот это время составляет 2-3 минуты.

Тема 4: Репарация

Хотя ДНК является достаточно стабильной молекулой благодаря «сокрытию» реакционноспособных групп внутри двухцепочечной молекулы и вследствие стойкости дезоксирибозы по сравнению с рибозой, все же она подвергается изменениям под воздействием следующих факторов:

– спонтанные мутации(частота 10^-4–10^-11), происходящие под воздействием тепловой энергии, активных метаболитов, при ошибках в работе ДНК-полимераз;

– индуцированные мутациипод воздействием УФЛ, ионизирующей радиации, многочисленных химических мутагенов;

– рекомбинативные процессы, осуществляемые при участии мобильных генетических элементов - МГЭ (плазмид, транспозонов, вирусов).

Важную роль в исправлении повреждений ДНК, вызванных мутациями и рекомбинациями, играет репаративная система клетки, включающая целый ряд разнообразных ферментов. Репаративные ферменты могут действовать точечно, исправляя локальные мутации (прямая репарация, фотореактивация), а могут и удалять достаточно крупные участки поврежденной ДНК (эксцизионная репарация, темновая репарация). Образовавшиеся при этом делеции застраиваются с использованием неповрежденной матричной цепи при участии репликативных ферментов. В случае особо мощного воздействия мутагенов включается SOS-индуцированная репарация, которая призвана сохранить ДНК любой ценой, даже допуская ошибочное встраивание нуклеотидов.

Классификация систем репарации

І. Система модификации и рестрикцииу бактерий

ІІ. Репликационная репарация – коррекция ДНК с помощью ДНК-полимераз и др. ферментов по ходу репликации.

ІІІ. Пострепликационная репарация(в основном рекомбинационная) – исправления повреждений в уже синтезированной ДНК.

Рассмотрим эти типы репараций.

І. МR-система (система рестрикции-модификации)

МR-система у бактерий представлена двумя типами ферментов: метилазами и рестриктазами и направлена на уничтожение чужеродной ДНК, проникающей в клетку извне или же на ДНК, образующуюся в результате спонтанных внутренних мутаций.

Метилазы метят метильными группами аденин и цитозин в определенных участках собственной ДНК – «горячих точках» рестрикции. Горячими точками рестрикции являются обычно небольшие палиндромы – участки ДНК, в которых относительно условной точки симметрии в транс-положении имеются инвертированные повторы, т.е. одинаковые, но повернутые относительно друг друга на 180⁰ , например:

А А Г Г Ц А Т Г Ц Ц Т Т

Т Т Ц Ц Г Т А Ц Г Г А А

Рис. 4.1. Пример палиндрома (стрелкой обозначена условная ось симметрии, относительно которой цепи повернуты на 180^О в транс-положении)

Рестриктазыв этих же сайтах («горячих точках» рестрикции) могут разрезать ДНК, если она не метилирована. Эта система защиты направлена прежде всего на проникающую в клетку чужеродную ДНК (в основном фаговую). Метилазная и рестриктазная активности могут принадлежать одному белку, а могут – двум разным белкам. Метилирование «своей» ДНК в специфических сайтах предотвращает ее от разрушения собственными рестриктазами. Действием метилаз можно объяснить появление в ДНК минорных азотистых оснований – 5-метилцитозина и 6-метиламинопурина. Они появляются сразу после репликации.

Сейчас известно более 400 микробных рестриктаз, которые распознают приблизительно 100 сайтов рестрикции. Рестриктазы могут разрезать ДНК с образованием «тупых» концов, т.е. с образованием равных фрагментов ДНК в месте гидролиза. Другие рестриктазы могут образовывать «липкие» концы, т.е. разрезают сайт рестрикции со смещением и образованием выступа в одной цепи разрыва и пробела – в другой цепи. Образованные липкие концы комплементарны друг другу. Это свойство рестриктаз широко используется в генной инженерии для встраивания генов в векторы – плазмиды, транспозоны, вирусы и др.

ААТТА---------------АЦТАТААТТ ААТТАА--------------ЦТАТААТТ

ТТААТТГАТ----------------АТТАА ТТААТТ--------------ГАТАТТАА

Рестрикция ДНК с образованием Рестрикция ДНК с образованием

«липких концов» «тупых» концов»

Рис. 4.2. Схема гидролиза ДНК рестриктазами с образованием

«липких» и «тупых» концов

Типы рестриктаз

Рестриктазы І типа: рестриктазы ЕсоВ и ЕсоК имеюттри субъединицы:

S-субъединица распознает сайт рестрикции;

М-субъединица – фермент метилаза;

R-субъединица – рестриктаза.

Донором СН₃-групп для метилирования является S-аденозилметионин. Сайтами узнавания для рестриктаз первого типа служат двусторонние и ассиметричные последовательности ДНК.

Рестриктазы ІІ типа (ЕсоRI, Bst I, Hind III, Alu I, Pst I и др.) – осуществляют только рестрикцию, метилирование производит другой фермент. Рестриктазы ІІ типа разрезают ДНК в неметилированных палиндромных сайтах (центральная симметрия с образованием тупых или липких концов).Эти ферменты очень специфичны, используются для рестрикционного анализа ДНК, а также в генной инженерии. EcoRI имеет две идентичных субъединицы. Сайты узнавания и рестрикции совпадают.

Рестриктазы ІІІ типа ‑ это рестриктазы промежуточного типа. В состав фермента входит и рестриктаза и метилаза, сайт узнавания находится неподалеку от сайта рестрикции.

Впервые рестриктазы были обнаружены у прокариот. У эукариот метилирование также происходит, но без рестрикции. Оно обеспечивает различное функциональное состояние генов. Защита от вирусов у эукариот осуществляется другим способом.