Разработка новых методов получения поликетидных антибиотиков

Термин «поликетидные» относится к классу ан­тибиотиков, которые образуются в результате последовательной ферментативной конденса­ции карбоновых кислот типа ацетата, пропионата и бутирата. Некоторые поликетидные ан­тибиотики синтезируются растениями и грибами, но большая их часть образуется актиномицетами в виде вторичных метаболитов. Прежде чем проводить манипуляции с генами, кодирующими ферменты биосинтеза полике-тидных антибиотиков, необходимо выяснить механизм действия этих ферментов.

Поликетидные антибиотики синтезируются по тому же пути, что и длинноцепочечные жир­ные кислоты. В результате каждого цикла кон­денсации к растущей углеродной цепи добавля­ется β-кетогруппа. Процесс состоит из ряда повторяющихся стадий, включающих восстанов­ление кетогруппы, дегидратацию и восстанов­ление β-еноильных групп в растущей поликетидной цепи. В зависимости от строения существуют два класса поликетидсинтетаз — ферментных комплексов, ответственных за синтез поликетидных анти­биотиков (рис.8). Синтетазы первого класса представляют собой один полипептид с одним активным центром, который последователь­но катализирует биосинтетические реакции (рис. 8, А). Второй класс включает синтетазы, образованные несколькими полипептидами (А- Е на рис. 8, Б); каждый из них имеет свой активный центр и обладает специфической ферментативной активностью, катализирующей определенную реакцию биосинтеза.

Если каждый домен много­функциональной поликетидсинтазы, обладаю­щий ферментативной активностью, катализи­рует определенную реакцию, то утрата любой из активностей затронет только одну реакцию биосинтеза, а изменение домена с известной функцией приведет к предсказуемым измене­ниям структуры синтезируемого антибиотика. Так, детально изучив генетические и биохими­ческие составляющие биосинтеза эритромици­на в клетках Saccharopolyspom erythraea, удалось внести специфические изменения в гены, ассо­циированные с биосинтезом этого антибиоти­ка, и синтезировать производные эритромици­на с другими свойствами. Для этого вначале была определена первичная структура фрагмента ДНК S. erythraeaдлиной 56 т. п. н., содержаще­го кластер генов ery, затем двумя разными спо­собами проведена модификация эритромицинполи-кетидсинтетазы. Для этого;

1) вносили изменение в участок ДНК, кодирующий еноилредуктазу,

либо

2) удаляли участок ДНК, кодирующий β-кеторедуктазу.

Делеция (удаление) β-кеторедуктазного гена приводила к накоплению промежуточного продукта, у которого к С-5-атому кольца была присоединена карбонильная группа, а не гидроксильная (рис.9Б), а мутация в гене еноил-редуктазы - к образованию двойной связи между атомами С-6 и С-7 (рис. 9А). Из этих экспериментов следует, что если идентифици­ровать и охарактеризовать кластер генов, ко­дирующих ферменты биосинтеза определен­ного поликетидного антибиотика, то, внося в них специфические изменения, можно будет направленно изменять структуру антибиотика. Кроме того, вырезая и соединяя по иному те или иные участки ДНК, можно перемещать домены поликетидсинтазы и получать принципиально - новые поликетидные антибиотики.