Искусственный синтез генов

Чтобы синтезировать ген искусственно, необходимо знать его последовательность нуклеотидов. В 1977 г. F. Sanger с сотрудниками предложили относительно простой, недорогой и надежный метод определения последовательности нуклеотидов ДНК (секвенирования ДНК) с помощью терминирующих дидезоксинуклеотидов (метод ферментативного копирования с остановкой удлинения цепи, осуществляемого ДНК-полимеразой). За его разработку он был удостоен Нобелевской премии по химии за 1980 г. (совместно с W. Gilbert). Возможность прямого секвенирования ДНК произвела настоящую революцию в молекулярной генетике. С помощью метода Сэнгера определена последовательность нуклеотидов не только отдельных генов, но и целых геномов, в том числе генома человека, а также ряда видов животных и растений. Вся эта бесценная информация хранится в международных базах данных и доступна с помощью Интернета для любого исследователя. Информация о нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК дает возможность идентифицировать кодирующую область гена, его регуляторные элементы, подобрать потенциальные праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР, см. ниже), выявить мутационные изменения в гене, определить последовательность аминокислот в протеине-продукте гена.

Белки-продукты многих генов хорошо известны и изучены, в том числе на предмет последовательности аминокислот в их молекулах. Зная эту последовательность и имея таблицу генетического кода, можно определить последовательность нуклеотидов в мРНК и в ДНК, которая должна при трансляции обеспечить синтез белковой молекулы именно с такой последовательностью аминокислот. Безусловно, искусственный ген не будет идентичен натуральному по той простой причине, что генетический код вырожденный: одной аминокислоте может соответствовать несколько сочетаний из трех нуклеотидов. Следует также иметь в виду, что гены высших организмов содержат некодирующие участки – интроны. Тем не менее, важен результат: искусственный ген, если его заставить работать, будет образовывать мРНК, с которой будет при трансляции синтезирован протеин, идентичный натуральному.

Современные ДНК-синтезаторы способны присоединять один нуклеотид к цепочке ДНК в течение нескольких минут, формируя фрагменты ДНК длиной более ста пар нуклеотидов. Соединяя отдельные фрагменты ДНК, можно получить полноразмерный ген. Таким методом был синтезирован, в частности, хорошо известный ген проинсулина человека, а также гены ряда других протеинов-продуктов современной биотехнологии.

Второй способ искусственного синтеза гена основан на использовании метода полимеразной цепной реакции, предложенного K.B. Mullis et al. (1986) (Рисунок 9. ). Метод ПЦР позволяет получать in vitro большое количество копий определенных последовательностей ДНК. Амплификация ДНК происходит в смеси, содержащей образец ДНК, два синтетических олигонуклеотидных праймера (длиной около 20 нуклеотидов), комплементарных участкам ДНК из противоположных цепей, фланкирующих (находящихся на концах) фрагмент, который предполагается амплифицировать, термостабильную ДНК-полимеразу (Taq-полимеразу), дезоксирибозидтринуклеотидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), ионы магния и буферный раствор. Первый этап ПЦР состоит в тепловой денатурации образца ДНК путем нагревания его до температуры около 95^оС. В результате температурного воздействия образуется однонитчатая ДНК. Второй этап – ренатурация (отжиг). Температуру смеси понижают до температуры около 55^оС. При этом праймеры соединяются (гибридизуются) с комплементарными последовательностями образца ДНК. Третий этап – синтез (элонгация ДНК). Температуру повышают до 75^оС, которая является оптимальной для термостабильной ДНК-полимеразы. На этом этапе происходит инициированное праймерами достраивание ДНК (синтез комплементарной цепи ДНК). Затем весь цикл многократно повторяют. Все реакции проводят в специальных пробирках в автоматическом термоциклере (амплификаторе), который обеспечивает точное соблюдение режима амплификации. Режим амплификации (температура и продолжительность отдельных этапов амплификации, количество циклов), а также состав реакционной смеси оптимизируют для каждого конкретного случая.

В результате многократного повторения реакций амплификации ДНК (обычно выполняют около 40 циклов) образуются многочисленные копии последовательности ДНК, заключенной между праймерами (рисунок 9.5 = рис 5.18 из Глика и Пастернака). Ее несложно идентифицировать в виде отдельной полосы на электрофореграмме, определить с помощью специальной калибровки ее длину (количество пар нуклеотидов). Можно элюировать ее из геля и использовать для изучения (например, секвенирования) или генетических манипуляций.

Метод полимеразной цепной реакции ДНК нашел исключительно широкое применение в молекулярно-генетических исследованиях. Он лежит в основе многочисленных диагностических методов, позволяющих выявлять в анализируемой ДНК определенные гены, ДНК различных патогенов. За разработку этого метода К.B. Mullis был удостоен Нобелевской премии по химии за 1993 г.

Если в международных базах данных содержится информация о сиквенсе интересующего нас гена какого-либо организма (или близких в систематическом отношении организмов), то можно с помощью специальных компьютерных программ подобрать праймеры, необходимые для амплификации кодирующей последовательности ДНК, используя в качестве исходной матрицы ДНК этого организма. Следует, правда, иметь в виду, что с помощью описанной технологии можно получить относительно короткие фрагменты ДНК (не более 3000 пар нуклеотидов). В связи с этим рекомендуют амплифицировать несколько перекрывающихся фрагментов ДНК кодирующей последовательности гена, а затем получить с помощью технологии рекомбинатных ДНК полноразмерный ген.

В тех случаях, когда отсутствует информация о сиквенсе интересующего нас гена, в реакции амплификации в качестве матрицы может быть использована его мРНК. В отдельных случаях мРНК некоторых генов можно выделить непосредственно из клеток, в которых они могут быть в большом количестве. Соответствующие мРНК выделяют, тщательно очищают и используют для синтеза комплементарной ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы, или ревертазы. Этот фермент был выделен в 1970 г. из РНК-содержащих онкогенных вирусов (его первооткрыватели H.M. Temin и D. Baltimor были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины за 1975 г.). Для начала реакции полимеразной цепной реакции ферменту нужна «затравка» (праймер) в виде небольшого отрезка двухцепочечной молекулы. Эукариотические мРНК содержат, как правило, на своем 3’-конце так называемый поли-А хвост, последовательность, состоящую из остатков аденина. Если к мРНК добавить синтезированные искусственно короткие олигонуклеотиды, состоящие из остатков тимина (поли-Т), они будут, в силу комплементарности, соединяться с поли-А, образуя двойную цепочку, которая и необходима для инициации ферментативной реакции полимеризации ДНК нуклеотидов. В результате образуется гибридная двухцепочечная РНК-ДНК молекула. Далее мРНК отщепляют от этой молекулы с помощью NaOH (нить ДНК при этом не повреждается). После этого остается одноцепочечная молекула ДНК, на конце которой имеется так называемая «шпилька» (короткий отрезок двухцепочечной ДНК), которая служит «затравкой» для синтеза второй цепи ДНК под действием фермента ДНК-полимеразы I. «Шпильку» далее удаляют с помощью фермента S1-нуклеазы, которая деградирует одноцепочечные ДНК. В конце концов, получается двухцепочечная молекула ДНК, одна из нитей которой комплементарна исходной мРНК. Такую ДНК называют кДНК (комплементарная ДНК) и она, в общем, соответствует структурному гену, с которого транскрибировалась мРНК. Разумеется, она не будет содержать интроны, которые могли быть у натурального гена (рисунок 9.6). Описанный метод синтеза кДНК получил название ОT-ПЦР – ПЦР с обратной транскрипцией (от англ. RT-PCR – reverse transcription PCR).

Полученную кДНК с помощью технологии рекомбинантных ДНК можно соединить с соответствующими регуляторными элементами, встроить в векторную плазмиду и перенести в клетки бактерий, где они будут, реплицироваться и экспрессироваться. По их продукту можно будет окончательно убедиться, ту ли, нужную нам мРНК, выделили.