Отбор продуктов слияния протопластов

После проведения слияния протопластов двух видов растений в смешанной суспензии можно обнаружить гетерокариоциты (продукты слияния протопластов разных видов), гомокариоциты (продукты слияния протопластов одного вида) и неслившиеся протопласты. Все они, в принципе, могут регенерировать клеточные стенки и перейти к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные клетки, чтобы можно было из них регенерировать соматические гибриды.

Поскольку существующие методы обеспечивают высокую частоту слияния протопластов, можно получить большое количество растений-регенерантов и проводить отбор гибридов на организменном уровне. Это можно делать по внешним признакам растений, особенно в тех случаях, когда родительские виды значительно различаются по морфологии или один или оба родителя имеют доминантные маркерные признаки. Можно для отбора использовать белковые (изоферменты) или ДНК-маркеры. Однако во многих случаях гибриды сложно отличить от родительских форм, особенно на ранних стадиях развития растений, частота регенерации гибридов может быть очень низкой. Поэтому их отбор рекомендуется проводить на уровне клеток, применяя следующие подходы (см. Глеба, Сытник, 1984).

Механическая изоляция. Сущность метода заключается в том, что используют морфологически различные типы родительских протопластов, например, протопласты из каллюсных клеток и мезофилла листа. После слияния гибридные протопласты выявляют визуально под микроскопом, изолируют микропипеткой и с помощью микроманипулятора переносят в отдельную каплю обогащенной питательных среды. Несмотря на требование специального оборудования и навыков работы с микротехникой, метод отличается довольно высокой эффективностью применительно к тем видам растений, для которых отработаны методы культивирования единичных клеток (см. раздел 3.7). Одним из вариантов метода механической изоляции гетерокарионов является использование прижизненной окраски родительских протопластов разными флюоресцентными красителями.

Генетическая комплементация. Для целей соматической гибридизации растений чаще всего используют генетическую комплементацию с участием хлорофилл дефектных мутантов, которые нередко специально для этого получают. Впервые предложили использовать хлорофилльные мутанты для отбора соматических гибридов, полученных путем слияния протопластов, Мельхерс и Лабиб в 1974 г. [Melchers, Labib, 1974].

Хлорофилльные мутации относятся к наиболее распространенным у высших растений. Их индуцировать относительно просто, например, с помощью таких мутагенов, как НММ и ЭМС [Сидоров, 1990]. Полученные пестролистные формы расхимеривают с помощью культуры клеток (наиболее эффективным считается получение растений-регенерантов в культуре протопластов из мезофилла листа). Хлорофиллдефектные мутанты нежизнеспособны в окружающей среде, однако их несложно поддерживать в условиях in vitro. Если слить протопласты мутантов, гомозиготных по разным рецессивным генам, полученные соматические гибриды в силу гетерозиготности по этим генам будут иметь фенотип дикого типа (нормальный). Продукты слияния могут приобретать зеленую окраску уже при культивировании каллюса на свету. Из такого каллюса регенерируют зеленые растения.

Помимо мутантов, дефектность хлорофилла которых обусловлена рецессивными ядерными генами, нашли применение также мутации, контролируемые пластомом (внеядерными генами), а также ядерные мутации с промежуточным доминированием. Недостатком метода является то, что стадия отбора гибридов отодвигается до уровня растений-регенерантов. Использование ауксотрофных мутантов позволяет проводить отбор соматических гибридов на клеточном уровне [Сидоров, 1990].

Физиологическая комплементация. Метод основан на способности гибридных клеток делиться и переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии. При этом неспособность родительских культур клеток к росту и морфогенезу не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является их нормальной физиологической реакцией на условия культивирования. Один из вариантов физиологической комплементации был использован Carlson et al. (1972) при получении первых соматических межвидовых гибридов табака. Было известно, что половые гибриды между N. glauca и N. langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях.

Основанный на физиологической комплектации подход, применимый не только к названной выше комбинации видов, предложил Э. Кокинг [Cocking et al. 1974]. Сущность метода заключается в том, что для соматической гибридизации используют родительские формы, существенно различающиеся по требованиям к условиям культивирования (условия, пригодные для одного из родителей, являются неприемлемыми для другого). После слияния протопластов смешанную суспензию клеток помещают сначала в питательную среду, в которой из-за неспособности к росту элиминируют клетки одного из родителей, а затем переносят в условия, вызывающие аналогичную элиминации клеток другого родителя.

Инактивация протопластов одного из родителей до слияния протопластов ионизирующим излучением (X-, γ- лучами в дозах 50÷300 Дж/кг) или биохимическими ядами (монойодацетатом, N-этилмалеимидом, диэтилпирокарбонатом, флюоридин-трихлорбензеном), необратимо подавляющих метаболизм клетки [Menczel et el. 1981, 1982, 1983]. В гибридных клетках способность к делению и морфогенезу в культуре in vitro восстанавливается.

Физическое обогащение заключается в разделении протопластов после слияния с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Продукты слияния протопластов двух родительских форм имеют промежуточное значение плотности по сравнению с родительскими формами. Благодаря этому их можно выделить в виде отдельной фракции. Физическое обогащение позволяет также повысить эффективность других методов селекции, например, генетической комплементации.