Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза

Под влиянием того или иного стимула морфогенеза каллюсная клетка становится детерминированной, то есть определившей путь, по которому будет проходить ее развитие. Однако не все клетки, а лишь одна из 400—1000 становится на путь вторичной дифференцировки, приводящей к морфогенезу. Следовательно, для перехода к морфогенезу недостаточно индуктора (стимула), а необходимо, чтобы клетка была готова к ответу на него. Способность воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него изменением программы развития называют компетентностью клетки.

Наиболее мощным индуктором органогенеза, который принято называть стимулом или сигналом морфогенеза, является изменение соотношения между концентрациями цитокининов и ауксинов, входящими в состав питательных сред. В своей ставшей классической статье (Skoog, Miller, 1957) Скуг и Миллер показали, что при культивировании каллюса, полученного из паренхимы стебля табака на питательной среде, содержащей ауксин (ИУК) и цитокинин (кинетин) приблизительно в равных молярных концентрациях имеет место интенсивная пролиферация клеток, при преобладании цитокининов над ауксинами часто начинается стеблевой органогенез, а в случае преобладания ауксинов – корневой (Рис. 3.5).

Использование экзогенных гормональных препаратов до настоящего времени является одним из основных подходов для получения растений-регенерантов у разных видов растений. При этом значительно расширился круг применяемых ауксинов и цитокининов и их аналогов, вошли в обиход для этих целей и другие регуляторы роста: гиббереллин, абсцизовая кислота, этилен. Выяснилось, что установленная Скугом и Миллером закономерность во многих случаях не соблюдается. Так, обнаружены виды, например, люцерна, у которых, в отличие от табака, преобладание ауксинов над цитокининами приводит к стеблевому органогенезу. Это объясняют различным уровнем эндогенных фитогормонов в тканях эксплантата, различной чувствительностью к регуляторам роста компетентных каллюсных клеток. Следовательно, в каждом конкретном случае для эффективной индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов необходимо искать оптимальное соотношение фитогормонов, максимально учитывать другие факторы, которые могут оказывать влияние на этот процесс, их возможное взаимодействие.

Органогенез в каллюсной ткани начинается с того, чтопод влиянием соответствующих воздействий (прежде всего, при изменении соотношения концентраций ауксинов и цитокининов в питательной среде) компетентная клетка или группа компетентных клеток обособляются от окружающих их каллюсных клеток, образуя зоны повышенной митотической активности – так называемые меристемоиды [Torrey, 1966] (иногда используется также термин «инициаль»). Меристемоиды обычно располагаются в нижней части каллюса, вблизи трахееподобных элементов, что обеспечивает контакт с питательной средой и восприятие гормонального стимула. Клетки меристемоидов отличаются от остальных каллюсных клеток небольшими размерами, имеют изодиаметрическую форму, тонкие стенки, многочисленные мелкие вакуоли. Крупное ядро обычно занимает центральное положение. В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и, соответственно, происходит стеблевой, корневой, листовой или флоральный органогенез. Формированию меристемоидов предшествует аккумуляция крахмала в зонах их расположения. Сам процесс органогенеза характеризуется значительными затратами энергии (усиление гликолиза и пентозофосфатного пути окисления углеводов). Показано, что морфогенез в культуре каллусных тканей табака характеризуется включением и выключением синтеза определенных белков-маркеров. Индуцированная детерминация клеток каллюсной ткани сопряжена с появлением в ней антигена-маркера клеток меристемы стебля.

Для индукции соматического эмбриогенеза обычно необходимо присутствие в питательной среде ауксина (чаще всего это 2,4-Д). Считается, что ауксин, а также другие индукторы эмбриогенеза (например, электрическое поле), применяемые для индукции соматического эмбриогенеза, изменяют полярность компетентных клеток, что приводит к появлению градиентов эндогенного ауксина, биоэлектрических потенциалов и кальция. Кроме того в клетках происходит перестройка элементов цитоскелета, которая связана с их поляризацией и последующими ассиметричными делениями. Именно мелкие дочерние клетки, образовавшиеся в результате ассиметричного деления являются эмбриогенными (детерминированными к эмбриогенезу). Предетерминированные эмбриогенные клетки могут также изначально присутствовать в тканях эксплантата, что позволяет получать соматические эмбриоиды непосредственно из клеток эксплантата (прямой соматический эмбриогенез) или получать из таких эксплантатов так называемый «эмбриогенный каллюс», из которого несложно получить большое количество эмбриоидов.

Эмбриогенные клетки отличаются от остальных каллюсных клеток малыми размерами, угловатой формой, более плотной цитоплазмой, мелкими вакуолями (около 30% объема клетки), множеством крахмальных зерен. Они имеют крупное ядро и большое количество рибосом. Микротрубочки у них имеют линейную ориентацию параллельно оси клетки. Между эмбриогенными клетками восстанавливаются плазмодесмы, которые практически отсутствуют в массе каллюсных клеток.

В результате деления эмбриогенных клеток формируется так называемый глобулярный проэмбрио. Условием его дальнейшего развития является перенос культур на питательную среду, содержащую пониженные концентрации ауксинов, или на полностью безгормональную среду. Устранение из питательной среды дедифференцирующего фактора (ауксина) приводит к тому, что проэмбрио превращается в глобулярный зародыш, который далее проходит стадии, характерные для развития зиготических зародышей: «сердечко», «торпедо», зрелый соматический эмбриоид. Соматические эмбриоиды имеют как стеблевые, так и корневые меристемы. Из стеблевого апекса формируется проросток. «Корневой» конец эмбриоида, как правило, направлен в сторону каллюса, в который «прорастают» образующиеся корни и откуда формирующееся растение получает необходимые элементы питания (Рис. 3.6).

Сравнительный анализ развития соматических и половых зародышей позволяет говорить о параллелизме их развития, который проявляется в основных закономерностях морфогенеза: биполярности, симметрии, клеточной и тканевой дифференциации. Изолировано несколько генов, которые экспрессируются в ходе соматического эмбриогенеза. Они классифицированы на три категории: 1) гены, вовлеченные в процесс деления клеток (21D7 и СЕМ1); 2) гены, связанные с формированием органов зародыша (CAR3, CAR4 и CHB4 с формированием гипокотиля; CAR5, CAR6 и CHB – с формированием гипокотиля и/или корней на стадии глобулярного зародыша и торпедо); 3) эмбрио-специфические гены (CHB2 и CEM6) [Komamine, 2001].