Обеспечение асептики при работе с культурой клеток растений

Как отмечалось выше, культура клеток растений может быть получена и успешно поддерживаться только при условии соблюдения асептики. Это достигается благодаря использованию различных методов стерилизации помещений, лабораторной посуды, инструмента, питательных сред. Особо тщательно стерилизуют поверхность эксплантатов, предназначенных для получения культуры клеток. Все работы, при которых открывают культуральные сосуды (разлив стерильной питательной среды по пробиркам, чашкам Петри, колбам, вычленение эксплантатов и их перенос на питательную среду, перенос части культуры на свежую питательную среду и др.) проводят в стерильных условиях в рабочем пространстве ламинар-бокса с соблюдением правил асептики.

Вся посуда (за исключением пластиковой одноразовой) перед употреблением должна быть стерилизована автоклавированием с последующим подсушиванием в сушильном шкафу или, при наличии в автоклаве вакуумной сушки, с использованием последней. Перед автоклавированием посуду заворачивают в крафт-бумагу или помещают в биксы, чтобы исключить их повторное заражение при транспортировке. Режим автоклавирования: давление 1,5 атм, время стерилизации 30-40 мин. Подсушивание в сушильном шкафу проводят при температуре около 100^оС в течение 30 – 40 мин.

Инструменты автоклавировать нельзя, так как они от этого портятся. Инструменты помещают в плотно закрывающийся металлический пенал, в котором их можно переносить из одного помещения в другое, и стерилизуют путем прогревания в сушильном шкафу при температуре 160^оС в течение 2-4 час. При работе в ламинар-боксе, чтобы избежать контакта инструментов с рабочими поверхностями, инструменты размещают на специальном, термостойком и огнеупорном (металлическом) штативе (Рис. 2.2). Инструменты в процессе работы (после каждого акта использования) стерилизуют погружением в 96% этанол и последующим обжиганием в пламени спиртовки (или газовой горелки, если ламинар-бокс ею оборудован). Так как горячие инструменты могут повредить растительные ткани, необходимо иметь, как минимум, двойной набор инструментов для проведения одной операции (один набор в работе, второй остывает). В некоторых лабораториях для стерилизации инструмента в ходе работы используют специальные, например, инфракрасные, нагреватели.

Перед работой проводится стерилизация ламинар-бокса с помощью встроенных бактерицидных ламп в течение 40 – 60 мин. За 10-15 минут до окончания обработки ламинар-бокса ультрафиолетом дополнительно включают активную продувку стерильным воздухом. Для этого устанавливают режим продувки ламинар-бокса 80 - 100% мощности. После окончания стерилизации выключают бактерицидные лампы, снижают поток воздуха до 40-60% мощности. Непосредственно перед работой рабочие поверхности ламинар-бокса протирают 96% этанолом. Сотрудник, проводящий работы в ламинар-боксе, должен протирать руки этиловым спиртом в начале и, периодически, в процессе работы.

Стерилизация поверхности растительных тканей перед вычленением эксплантатов и помещением их на питательную среду является одним из наиболее важных этапов получения культуры клеток растений, так как во многих случаях добиться полной их стерильности очень сложно. Успех стерилизации зависит от целого ряда факторов. Как правило, эксплантаты от растений, выращенных в условиях закрытого грунта, намного чище по сравнению с эксплантатами от растений, выращиваемых в поле. Сильно загрязнен растительный материал подземных органов растений (клубней, луковиц и т.п). Их перед стерилизацией необходимо тщательно вымыть в мыльном растворе и прополаскать дистиллированной водой. Сложно стерилизовать растительный материал густо опушенных тканей (покрытых волосками), что затрудняет контакт стерилизующих агентов с поверхностью из-за образующихся пузырьков воздуха. Для их стерилизации применяют специальные приемы, описанные ниже. Наконец, решающим может быть выбор стерилизующих агентов. Для поверхностной стерилизации растительного материала используют растворы гипохлорита кальция или натрия (5-10%), раствор перекиси водорода (10-12%), бромную воду (1-2%), растворы нитрата серебра (1%), сулемы (хлорида ртути, 0,1%)) и другие агенты, которые можно найти в каталогах фирм, производящих реактивы для культуры клеток растений. В особо «трудных» случаях в питательную среду добавляют антибиотики.

В работе автора книги высокая эффективность стерилизации эксплантатов была достигнута при использовании 70% этанола и диацида. Диацид представляет собой 0,1% раствор этанолмеркурихлорида C₂H₅ClHg и цетилпиридинилхлорида C₂₁H₃₈NCl ∙ H₂O. Его можно использовать многократно: при правильном хранении он сохраняет эффективность в течение одного года и более. Стерилизуемый растительный материал погружают сначала в спирт (30-40 сек), затем в раствор диацида (7-10 мин). После этого его тщательно промывают в 4-5 порциях проавтоклавированной дистиллированной воды.

Для того, чтобы улучшить смачивание стерилизуемых опушенных поверхностей эксплантатов, применяют так называемую вакуумную стерилизацию. Для ее проведения растительный материал помещают в колбу Бунзена, в которую заливают стерилизующий раствор. Колбу подсоединяют через отводок к вакуумному насосу и с его помощью откачивают из нее воздух.

Вычленение эксплантатов и перенос их в культуральные сосуды на питательную среду производят непосредственно после стерилизации растительного материала. Эту процедуру выполняют в ламинар-боксе, тщательно соблюдая правила асептики. В простейшем случае стерилизованный растительный материал помещают в открытые проавтоклавированные чашки Петри и стерильным инструментом (скальпелем или ножницами) вырезают фрагменты растительного материала нужного размера. Пробирки открывают в пламени спиртовки и с помощью стерильного длинного пинцета или уретальных щипцов эксплантат переносят на поверхность питательной среды. Для каждой очередной такой операции используют новые автоклавированные чашки Петри и простерилизованный (погружением в 96% этанол с последующим прожиганием в пламени спиртовки) и охлажденный инструмент.

В некоторых случаях эксплантаты весьма мелкие, их необходимо освободить от покровных тканей (например, пыльники, которые извлекают из простерилизованных цветочных бутонов, колосков). Для такого случая удобно использовать проавтоклавированную подложку из двойных листов целлофана, переложенных крафт-бумагой. Растительный материал, например, цветочные бутоны, помещают, ближе к краю, между двух листов целлофана и, придерживая их сверху пальцем (через целлофан), извлекают стерильным инструментом пыльники, не опасаясь их контаминации.Одной пары целлофановых листов размером 15 × 15 см хватает для извлечения пыльников из 8 - 12 бутонов (по 2-3 с каждой стороны).