СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ 6 глава

Существуют и мембранные PRR, например, на макрофагах есть Рц для маннозы — лектин C–типа и способен связывать ряд бактериальных клеток и вирусов, в том числе ВИЧ. Связывание Рц для маннозы влечет за собой фагоцитоз связанного лиганда. На тех же макрофагах выявлено минимум 6 вариантов так называемых Рц для мусора (scavenger receptors). Это тоже Рц фагоцитоза, и распознают они некоторые анионные полимеры, ацетилированные липопротеины низкой плотности, участки мембран клеток своего организма, утратившие экран из сиаловых кислот (по такому механизму макрофаги фагоцитируют старые эритроциты).

Есть примеры, когда микробный продукт распознаёт растворимый Рц, а их комплекс связывает другой Рц — на фагоците. Так происходит с характерным компонентом грамотрицательных бактерий — ЛПС. Его распознаёт и связывает белок сыворотки — LBP, а их комплекс (ЛПС + LBP) распознаёт и связывает Рц на макрофаге — CD14. В молекулах LBP и CD14 — в обеих — присутствуют повторяющиеся последовательности АК, богатые лейцином. Сам по себе Рц CD14 — непроводящий, несигнализирующий (во всяком случае таких данных нет). Однако как только CD14 оказывается связанным своим лигандом, с ним вступает в ассоциацию другой Рц — TOLL–подобный Рц макрофагов TLR–4. Именно он проводит внутрь клетки особый сигнал, вызывающий экспрессию в макрофагах определённых цитокинов доиммунного воспаления, обеспечивающих развитие защитных сосудистых реакций, хемотаксис нейтрофилов и моноцитов в очаг, активацию дендритных клеток и их миграцию из покровных тканей в регионарные лимфатические узлы. Это необходимый процесс для инициации развития лимфоцитарного иммунного ответа на тот случай, если доиммунное воспаление не остановит развитие инфекции.

TLR–4 открыли у мышей, генетически не реагирующих на попадание ЛПС в организм. ЛПС является причинным агентом для развития клинических симптомов септического шока. Так вот, у таких мышей не выявили дефектов ни в LBP, ни в CD14, у них оказался инактивированным ген TLR–4. Отвечаемость на ЛПС таким мышам удалось привить путём введения трансгена TLR–4. В дальнейшем выяснили, что в мембране клетки Рц TLR–4 взаимодействует с комплексом «CD14 + LBP + ЛПС» через богатый лейцином внеклеточный домен молекулы CD14. У мышей с мутацией в гене TLR–4 не развиваются болезненные симптомы септического шока, но их организм не способен защититься от ЛПC–содержащих бактерий (например, Salmonella typhimurium), и мыши погибают от сепсиса. У нескольких людей, «не справляющихся» с локализацией инфекции грамотрицательными бактериями, организм которых «допустил» бактериемию, т.е. грамотрицательный сепсис, тоже нашли мутации в гене TLR–4.

Термины «TOLL» и «TOLL–подобные Рц» появились в словаре иммунологов с 1998 г. Пионерские же исследования этих Рц были выполнены C. Nusslein-Vollhardt, K.V. Anderson и коллегами на плодовых мухах дрозофилах в 1985–1988 гг. и поначалу не имели отношения к иммунитету.

TOLL–Рц назвали некие вновь открытые молекулы клеточной мембраны, необходимые для правильного дорсовентрального морфогенеза в процессе эмбрионального развития мух Drosophila melanogaster. В дальнейшем, почти через 10 лет, нашли, что те же TOLL–Рц у взрослых мух ответственны за защиту организма от грибов и бактерий, так как сигнал с TOLL–Рц обеспечивает биосинтез антигрибковых и антибактериальных пептидов (дрозомицина). В эти же годы (1991–1995) в независимых работах обнаружили, что в цитоплазматическом участке Рц для ИЛ–1 у млекопитающих существует явная гомология с цитоплазматическими последовательностями TOLL–Рц плодовых мух. С этого момента исследования приняли уже более целенаправленный и азартный характер, так как появился намек на то, что в поле научного зрения попали молекулы (именно эти TOLL, в переводе с английского — звон колокольчика у входных дверей), имеющие прямое отношение к защите от микробных инфекций у столь филогенетически далеких многоклеточных, как плодовые мухи и млекопитающие. Гомологичные сигнальные последовательности в цитоплазматических участках интересующих Рц получили отдельное наименование — TIR (Toll/Interleukin–1 receptor).

В настоящее время TOLL–Рц понимают как древний сигнальный путь защитного назначения, имеющийся у всех многоклеточных организмов, включая растения, беспозвоночных и позвоночных животных.

У человека по завершении программы «Геном человека» нашли 10 аналогичных (или гомологичных) кодирующих последовательностей нуклеотидов и соответствующих TOLL–подобных белков. Их лиганды и значение в жизненных процессах в настоящее время активно изучают. Соответствующие Рц у млекопитающих стали называть TOLL–подобными (TLR — TOLL–like receptors). Пока что TLR у млекопитающих выявили на дендритных клетках и макрофагах. Кроме TLR–4, сигнализирующего о наличии ЛПС грамотрицательных бактерий, у млекопитающих описан ещё TLR–2, который сигнализирует о наличии ряда иных микробных продуктов, а именно протеогликанов грамположительных бактерий. Частично охарактеризованы Рц дендритных клеток TLR–7 и TLR–9. Их лиганды — вирусные продукты и бактериальная ДНК, содержащая неметилированные нуклеозиды CpG. Подробности этого распознавания в настоящее время изучают. Но уже показано, что активация дендритных клеток и макрофагов млекопитающих через TLR имеет следствием активацию в клетке определённого «древнего» фактора транскрипции — NFkB, что приводит к следующим биологическим последствиям:

· в этих клетках инициируется транскрипция с последующей экспрессией продуктов генов провоспалителъных цитокинов (TNFa, ИЛ–1, ИЛ–6, ИЛ–12 — набор и соотношения цитокинов — разные при разных патогенах) и хемокинов (ИЛ–8); TNFa обеспечивает такую активацию дендритных клеток в покровных тканях, которая необходима для осуществления их миграции в регионарную лимфоидную ткань по путям лимфодренажа;

· происходит экспрессия костимуляторных молекул B7.1 (CD80) и B7.2 (CD86), без которых дендритные клетки и макрофаги не могут выполнить функции АПК для T–лимфоцитов, т.е. возможность начала развития лимфоцитарного иммунного ответа in vivo облигатно зависит от факторов доиммунного воспаления в очаге проникновения патогена.

Кстати, задолго до получения современных молекулярно–генетических данных, иммунологи эмпирически подобрали и уже давно используют микробные продукты в качестве адъювантов — усилителей искусственно индуцируемого иммунного ответа при вакцинациях или экспериментальных иммунизациях (ЛПС, гликаны, маннаны, мурамил дипептид микобактерий).

Подробности структуры и функций лимфоцитарных Рц для патогенов будут рассмотрены в последующих главах, но здесь уместно кратко сравнить по ряду свойств «доиммунные» первичные Рц для патогенов (PRR, TOLL) и Рц лимфоцитов для Аг (TCR, BCR). Как можно понять из табл. 3.1, большинство этих свойств, как ни удивительно, взаимно противоположны. Но на самом деле эта разность свойств помогает понять эволюционную полезность сосуществования и взаимодополнения доиммунных и лимфоцитарных механизмов защиты от инфекций.

Таблица 3.1. Сравнение биологических свойств «доиммунных» и лимфоцитарных рецепторов распознавания патогенов и наступающих за распознаванием защитных процессов

Существуют субпопуляции лимфоцитов со свойствами, «промежуточными» между таковыми неклонотипных доиммунных механизмов резистентности и клонотипных лимфоцитов с большим разнообразием Рц для Аг. Примеры таких лимфоцитов следующие:

· NK (нормальные киллеры) — лимфоциты, у которых нет Рц, кодируемых перестроенной ДНК, но есть особые Рц, распознающие Аг MHC–1 не вполне пока понятым способом. Кроме того, на NK есть такие иммунорецепторы, как FcgR;

· внутриэпителиальные лимфоциты Tgd с перестроенными генами TCR, но ограниченного разнообразия (связывают лиганды типа белков теплового шока, нетипичные нуклеотиды, фосфолипиды, MHC–IB);

· B₁–лимфоциты, локализованные в брюшной и плевральной полостях, также с перестроенным BCR, но ограниченного разнообразия, с широкой перекрестной реактивностью с микробными Аг.

Названные субпопуляции лимфоцитов не пролиферируют после связывания Аг (т.е. не происходит экспансии клонов), но в них сразу индуцируется продукция эффекторных молекул. Ответ не слишком специфичен, наступает быстрее, чем «истинно лимфоцитарный», иммунологической памяти не остаётся.

Рассмотрим подробнее конкретные антибактериальные защитные системы: комплемент, белки острой фазы, фагоцитоз и противовирусную доиммунную защиту (интерфероны — ИФН). В заключение опишем в целом процесс доиммунного воспаления как необходимый пролог возможного иммунного ответа.

3.2. Система комплемента

Комплемент обнаружен на переломе XIX и XX веков (Бюхнер, Борде, Эрлих) в виде гипотетического фактора, присутствующего в нормальной сыворотке крови, инактивируемого прогреванием сыворотки при 56 °C, обладающего свойствами опсонизировать бактерии для фагоцитоза и содействовать лизису бактерий в присутствии антибактериальных АТ, т.е. это «что-то» дополняет (complementer) АТ в ходе лизиса и фагоцитоза бактерий.

В дальнейшем выяснили, что комплемент — это система сывороточных белков и нескольких белков клеточных мембран. Девять первых открытых белков системы комплемента обозначили буквой «С» (по первой букве слова «complement») с цифрой: C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9. В процессе реализации своей биологической активности первые пять белков комплемента расщепляются в определённой последовательности на активные действующие продукты «запланированного» расщепления. Эти продукты обозначают «С» с номером и малой латинской буквой, например C1q, C5a, C2b. Букву «b» присваивают большему по размеру фрагменту, букву «а» — малому фрагменту. Часть из компонентов комплемента является протеазами, часть выполняет другие функции: связывание с микроорганизмами и мембранами клеток, связывание с комплексами «АТ–Аг», активация тучных клеток и, следовательно, сосудистых реакций воспаления, перфорация мембран бактериальных клеток. Остальные компоненты обозначают каждый своей аббревиатурой (табл. 3.2).

Таблица 3.2. Компоненты комплемента, их функции и обозначения

Всего вместе с ингибиторами и регуляторами в табл. 3.2 перечислено 30 компонентов системы комплемента.

· В и D — белки системы комплемента, обнаруженные позже компонентов под аббревиатурой «С», и получившие «имя» по соседним с «С» буквам латинского алфавита. Номера при букве «С» присваивали по мере обнаружения конкретных белков, и их порядок (1, 2, 3 и т.д.) не соответствует физиологической очередности вступления в действие в процессе активации всей системы.

· CR — complement receptor — это названия Рц (которых как минимум 5), связывающих определённые белки комплемента на мембране собственных клеток организма (фагоцитов, B–лимфоцитов, небольшой части T–лимфоцитов и в меньшей степени других клеток).

· Clinh (C1–inhibitor) — ингибитор компонента C1.

· MCP — membrane–associated cofactor of proteolysis — мембранный белок, связывающий C3b, что делает C3b доступным для деградации протеазой — фактором I.

· DAF — decay accelerating factor — белок мембраны клеток млекопитающих, ускоряющий деградацию (инактивацию) компонента C2b.

· H — фактор H — сывороточная протеаза, деградирующая C3b.

· I — фактор I — протеаза, деградирующая компоненты C3b и C4b.

· P — фактор P (или пропердин) — стабилизатор активного комплекса C3b/Вb.

· CD59 — мембраный белок, препятствующий вызванному комплементом лизису собственных клеток.

Подробная характеристика белков комплемента приведена в табл. 3.3.

Таблица 3.3. Система комплемента

В норме, когда внутренняя среда организма «стерильна» и нет патологического распада собственных тканей, система комплемента находится в «спящем состоянии», т.е. уровень спонтанной активности без «спроса» на нее невысок. «Спрос» на работу системы комплемента возникает при появлении во внутренней среде определённых раздражителей, а именно микробных продуктов. Известно 3 пути активации системы комплемента, называемых классическим, альтернативным и лектиновым.

Альтернативный путь активации инициируется непосредственно клетками микроорганизмов.

Компоненты комплемента, которые, будучи в активной форме, являются протеазами и работают как с субстратами с другими компонентами комплемента, называют конвертазами с обозначением объекта конверсии (т.е. превращения). Например, C3–конвертазы — это протеазы, способные расщеплять белок C3 на функционально активные компоненты C3b и C3a.

Опишем альтернативный путь активации комплемента микробными клетками.

В сыворотке крови всегда имеется небольшой, но значимый уровень спонтанного расщепления C3 белка с образованием C3b и C3a. Из всех белков системы комплемента в сыворотке крови больше всего именно C3: его концентрация в норме составляет 1,2 мг/мл. Компонент C3b способен ковалентно связываться с поверхностными молекулами не всех, но некоторых микроорганизмов. Для C3b есть Рц на фагоцитах, и C3b, таким образом, является самым «энергичным» опсонином в системе комплемента.

Кроме того, связанный с поверхностью микробных клеток C3b активирует другие компоненты системы следующим образом: C3b связывает фактор В (который, кстати, структурно и функционально гомологичен белку C2). Будучи связанным, фактор В становится субстратом для сывороточной сериновой протеазы — фактора D. Протеаза расщепляет белок В на фрагменты Ва и Bb. Bb в свою очередь является активной протеазой. Bb остаётся связанным с C3b на поверхности микроба, образуя активный комплекс C3b/Bb, который по функциональной активности есть C3–конвертаза — самая значимая при альтернативном пути активации системы комплемента. Комплекс C3b/Bb является структурным и функциональным гомологом главной C3–конвертазы классического пути — C4b/C2b. Гены гомологичных белков C2 и фактора В локализованы рядом в области MHC–III. В сыворотке крови млекопитающих есть белок, стабилизирующий комплекс C3b/Bb — это пропердин, или фактор Р.

В результате нарабатывается много C3b: одна единица C3–конвертазы «высаживает» на поверхность микробной клетки около 1000 молекул C3b, который выполняет противомикробную работу. Кроме названной выше опсонизации для фагоцитоза, комплекс C3b/Bb является активной C5–конвертазой, т.е. расщепляет C5 до фрагментов C5a и C5b. Малые фрагменты C5a (самый сильный) и C3a служат медиаторами воспалительной реакции, т.е. создают условия для экстравазации из сосудов в очаг жидкости и клеток крови. Эти компоненты называют анафилатоксинами комплемента. Для них существуют специальные Рц, по крайней мере на тучных клетках (выбрасывающих в качестве реакции содержимое своих гранул) и на гладких мышцах (реагирующих сокращением). C5a действует также прямо на нейтрофилы и моноциты (т.е. фагоциты), повышая их адгезию к стенке кровеносного сосуда, их экстравазацию и фагоцитарную активность. Кроме того, C5a вызывает повышение экспрессии на фагоцитах Рц CR1 и CR3.

С C5b начинаются реакции белков комплемента C6, C7, C8 и C9, коллективно получивших название «мембраноатакующий комплекс», посколько эти реакции завершаются формированием неспадающихся пор в мембране микробных клеток (перфорацией мембраны) и, как следствие, лизисом микробных клеток. Одна молекула C5b связывает одну молекулу C6. Образовавшийся комплекс C5b/C6 присоединяет одну молекулу C7. У молекулы C7 есть гидрофобный домен, через который весь комплекс C5b/C6/C7 встраивается в фосфолипидный бислой мембраны микробной клетки. К этому комплексу своими гидрофобными доменами пристраиваются белки C8 и C9. C8 — комплекс двух белков: C8b присоединяется к C5b, а C8ag встраивается в фосфолипидный бислой. Будучи встроенным, C8ag катализирует полимеризацию 10–16 молекул C9. Данный полимер и формирует неспадающуюся пору в мембране диаметром около 10 нм.

В реальной защите от инфекций этот, казалось бы, мощный деструктивный механизм имеет ограниченные возможности. При генетических дефектах в компонентах C5–C9 единственный фенотипический дефект в противомикробной защите у человека — повышенная восприимчивость к инфекции Neisseria spp, вызывающей такие заболевания, как гонорея и бактериальный менингит.

Классический путь активации комплемента инициируется комплексами Аг–АТ. На молекулах IgM, IgG3 и в меньшей мере IgG1 есть специальные реакционно–способные места, которые после формирования комплекса Аг–АТ способны связывать компонент C1 комплемента, а именно субкомпонент C1q. Молекула C1 состоит из 8 СЕ, 6 из которых одинаковые: C1q (имеющий глобулярную головку и коллагеноподобный хвост), по одной C1r и C1s. Реакция связывания C1q с иммуноглобулинами не происходит в растворе, но требует концентрации на твёрдой фазе — на поверхности микробных клеток. Каждая головка C1q вступает в связь с одним Fc–участком молекулы иммуноглобулина. Активация молекулы C1 требует связывания более двух головок C1q. Ферментом (протеаза) является C1r. Будучи активированной, C1r отщепляет C1s, которая является активной сериновой протеазой. Протеаза C1s расщепляет компоненты системы — сначала C4, C2. C4b способен ковалентно связываться с поверхностью микробных клеток (важно, что не собственных эукариотических клеток) и там присоединять к себе C2. Здесь C2 расщепляется той же протеазой C1s. Большие фрагменты C4b и C2b объединяются и становятся главной C3–конвертазой классического пути — комплексом C4b/C2b. В этом комплексе протеазной активностью обладает C2b. C3–конвертаза нарабатывает большие количества C3b. Дальнейшие процессы по механизму совпадают с процессами альтернативного пути активации системы комплемента. Кстати, классический и альтернативный пути активации действуют параллельно, более того, амплифицируя (усиливая) друг друга, а не «или, или».

Рассмотрим Рц для компонентов комплемента на клетках (CR — complement receptors) организма и их функциональные роли. Известно 5 типов CR (табл. 3.4).

CR1, экспрессированный на фагоцитах (макрофагах, нейтрофилах), связывает C3b. Однако только одно это связывание не стимулирует фагоцитоз, но оказывает пермиссивное действие при наличии других стимулов к фагоцитозу — связывание комплексов Аг–АТ через Fcg–Рц или стимуляций g–ИФН (продуктом иммунных T–лимфоцитов).

Таблица 3.4. Клеточные рецепторы для компонентов комплемента

CR1 есть на эритроцитах. После многих инфекций в крови накапливается немало растворимых иммунных комплексов. Их пребывание в циркуляции неблагоприятно для стенок сосудов. Активные компоненты комплемента C4b и C3b ковалентно связывают растворимые иммунные комплексы и через CR1 привязывают их к эритроцитам, которые уносят их с собой к макрофагам селезёнки и печени, обеспечивая тем самым клиренс крови от иммунных комплексов. При этом макрофаг «снимает» иммунный комплекс с эритроцита, не повреждая сам эритроцит. Если этот механизм клиренса крови от иммунных комплексов оказывается недостаточным, то «неубранные» комплексы выпадают в осадок. Этот процесс особенно заметен в базальных мембранах сосудов клубочков почек (CR1 есть и на подоцитах клубочков почек), где он вызывает патологический синдром гломерулонефрита.

C5a–Рц состоит из 7 доменов, пенетрирующих мембрану клетки. Такая структура характерна для Рц, ассоциированных с так называемыми G–белками (белками, способными связывать гуаниновые нуклеотиды).

CR2, CR3 и CR4 связывают C3bi — инактивированную форму C3b, которая остаётся связанной с поверхностью микробной клетки и служит, таким образом, в качестве опсонина. Более того, в отличие от связывания активной формы C3b с CR1 само по себе связывание C3bi с CR3 достаточно для стимуляции фагоцитоза.

Ещё один продукт деградации C3b—C3dg связывается только с CR2. Рц CR2 является существенным корецептором B–лимфоцита. CR2 связывает C3bi и/или C3dg, и это связывание увеличивает в 100–10 тыс. раз восприимчивость B–лимфоцита к своему Аг. К сожалению, эту же мембранную молекулу — CR2 — выбрал в качестве своего Рц вирус Эпштейна–Барр (EBV) — возбудитель инфекционного мононуклеоза.

У людей с генетическими дефектами в C3 или молекулах, обеспечивающих выпадение C3b на поверхности микробных клеток, клинически имеется уязвимость ко многим внеклеточным бактериальным инфекциям.

Собственные клетки организма защищены от деструктивных воздействий активного комплемента благодаря так называемым регуляторным белкамсистемы комплемента. Часть этих белков — мембранные (табл. 3.5), часть — сывороточные. Один из сывороточных регуляторов — C1–ингибитор (Clinh). Он связывает активный ферментный комплекс C1r/C1s, отрывает его от C1q, который остаётся связанным с Fc–фрагментом АТ на поверхности микробной клетки. Тем самым Clinh ограничивает время, в течение которого C1s катализирует активационное расщепление C4 и C2. Кроме того, Clinh ограничивает спонтанную активацию C1 в плазме крови. При генетическом дефекте Clinh у человека имеется заболевание, называемое наследственным ангионевротическим отёком. Патогенез заболевания состоит в хронически повышенной спонтанной активации системы комплемента. Избыточное накопление, в том числе фрагментов C2a, приводит к повышенному образованию пептида-деривата C2a—C2–кинина. Этот кинин, а также избыточно образующийся брадикинин (тот же ингибитор Clinh регулирует и другие протеазы плазмы) вызывают отёки. Заболевание полностью излечивается заместительной терапией препаратом Clinh.