ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

Развитие методов, инструментов и подходов генетической инженерии растений позволяет решить в селекции наряду с классическими методами рад важных задач:

Ø повысить устойчивость новых форм, линий, сортов и гибридов сельскохозяйственных растений к неблагоприятным условиям окружающей среды, патогенам, вредителям, гербицидам и др.;

Ø сократить сроки выведения новых сортов;

Ø повысить пищевую ценность сельскохозяйственных растений и декоративные качества культурных растений;

Ø замедлить процессы старения растений;

Ø снизить технологические затраты при выращивании сельскохозяйственных растений и сделать растениеводство более экономически выгодным.

Решение этих задач основано на технологии рекомбинантных ДНК, которая позволяет выделить гены как прокариотического, так и эукариотического происхождения, перенести интересующий исследователя ген в хромосомы реципиентного растения и обеспечить его экспрессию, а также стабильное наследование признака в поколениях. Существенным моментом применения этой технологии является регенерация жизнеспособных взрослых растений из трансформированных клеток, основанная на свойстве тотипотентности. Тотипотентность – свойство соматических клеток растений полностью реализовать свою наследственную программу онтогенетического развития при определенных условиях выращивания вплоть до образования взрослых растений и семян. Таким образом, из клеток, сконструированных генно-инженерными методами, можно получить трансгенные растения, все клетки которых будут содержать чужеродный ген. Новый признак, контролируемый чужеродным геном, будет передаваться последующим поколениям при семенном размножении.

Таким образом, технология рекомбинантных ДНК лежит в основе технологии получения трансгенных растений, включающей следующие этапы: выбор гена и его клонирование; подбор генотипа растения-реципиента; введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента; регенерация растений из трансформированных клеток и отбор трансгенных растений.

Выбор гена и его клонированиеопределяется задачами, направленными на придание растениям определенного хозяйственно-полезного моногенного признака, а именно устойчивость к гербицидам, пестицидам, или насекомым, устойчивость к некоторым видам стрессов, устойчивость к инфекции и др. Большинство генов, определяющих эти признаки, выделены из бактериальных геномов или геномов диких видов растений.

Подбор генотипа растения-реципиента основывается на ряде требований. В качестве реципиента подбираются растения высокоурожайного сорта, устойчивого к биотическим и абиотическим стрессам, но имеющего лишь одно отрицательное свойство, например неустойчивость к вредителям, которое могло бы быть передано с помощью генно-инженерных методов. Также выбор генотипа растения-реципиента определяется способностью его клеток к регенерации в целое фертильное растение, так как показано, что это свойство значительно зависит от генотипа.

Введение гена в геном растения-реципиента осуществляется различными методами при помощи векторов.

Векторы для введения чужеродного гена в геном растительной клетки были найдены при изучении причин опухолевого заболевания растений, известного как корончатый галл. Было выяснено, что вызывают опухоль у растений Ti-плазмиды некоторых штаммов почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens. Ti-плазмиды способны проникать в клетки растений, а часть ее включается в их ДНК.

Ti-плазмиды относятся к классу коньюгативных плазмид и представляют собой кольцевые молекулы ДНК размером 50-80 мкм и длиной до 200 тыс. п.н. Около 10% (~ 23 тыс. п.н.) Ti-плазмиды составляет трансформирующая область (Т-область или Т-ДНК). Т-область несет гены синтеза опина, гены синтеза ауксина и гены синтеза цитокинина. Наличие Т-ДНК необходимо, но недостаточно для трансформации. В Ti-плазмиде имеется еще область вирулентности (vir-область), которая составляет 40 тыс. п.н. и расположена вне Т-ДНК. Vir-область отвечает за вырезание Т-области и перенос ее в геном растительной клетки. Эта область содержит семь генов, одна часть которых экспрессируется в бактериальной клетке постоянно, а другая начинает экспрессироваться только после активации их промоторов и кодирует белки для вырезания и переноса Т-области.

Процесс трансформации растений с помощью агробактерий, обитающих в их ризосфере, происходит следующим образом. При повреждении растения в нем начинают синтезироваться специфические фенольные вещества – ацетосиренгон и гидроксиацетосиренгон, которые узнаются мембранным рецепторным белком vir-области клетки агробактерии. В ответ на этот химический сигнал в клетке A. tumefaciens активируются промоторы четырех генов хромосомной ДНК,осуществляющих синтез специальных полисахаридов на поверхности бактериальной клетки, необходимых для присоединения бактерии к растительной клетке. В результате этого, агробактерия оказывается способной прикрепиться к клеткам растения в месте поранения, обычно у основания стебля. Происходит активация промоторов генов vir-области Ti-плазмиды, необходимых для инициации переноса Т-ДНК в ядро растительной клетки. Белковые продукты этих генов вырезают Т-область и транспортируют ее в растительную клетку, по-видимому, с помощью механизма, аналогичного механизму переноса ДНК из донорной клетки в реципиентную в процессе коньюгации. Т-ДНК встраивается в хромосомы инфицируемого растения.

Встроенная Т-ДНК начинает экспрессироваться в геноме растения. Т-ДНК вызывает образование опухоли, гиперпродукцию фитогормонов (цитокининов и ауксина), а также синтез ряда производных аминокислот, объединяемых под общим термином опины. Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, от которого зависит нормальный морфогенез растения. Опины, выделяемые клетками опухоли растения, в качестве источников углерода и азота могут использоваться только инфицируемой бактерией A. tumefaciens, поскольку только у ее Ti-плазмиды есть гены, отвечающие за катаболизм этих опинов. Таким образом, в процессе эволюции сформировался механизм превращения растительной клетки в «фабрику» по производству вещества – источника углерода и азота, исключительно для нужд A. tumefaciens.

Такие взаимоотношения A. tumefaciens и высшего растения Дж. Шелл назвал генетической колонизацией, которая представляет собой эксперимент по генетической инженерии, представленный самой природой, а Ti-плазмида является природным вектором для трансформации клеток высших растений. Кроме того Дж. Шелл показал, что если из клеток корешков табака с интегрированной Т-ДНК получить каллус, а затем растения-регенеранты, то при последующем генетическом анализе признак «присутствие Т-ДНК» обнаруживает менделевское расщепление.

В качестве векторов для клонирования генов и последующей трансформации растений используют две разновидности Ti-плазмид. Они отличаются по типу опинов (октопины или нопалины), которые синтезируют инфицированные ими растения. Клонируемый ген встраивают вместо кодирующей части генов октопинсинтетазы или нопалинсинтетазы, входящих в состав Т-ДНК.

Однако, несмотря на то, что Ti-плазмиды являются эффективными природными векторами, имеется ряд серьезных ограничений на их использование в качестве векторов для клонирования:

1) фитогормоны, синтезируемые трансформированными растительными клетками, подавляют регенерацию в культуре этих клеток, поэтому при конструировании векторов на основе Ti-плазмиды гены аксина и цитокинина должны быть удалены;

2) ген опина несущественен для трансформированных растений, но при его наличии может снижаться конечный выход биомассы, поскольку часть ресурсов расходуется на синтез опина. Следовательно, при создании векторов ген опина также должен быть удален;

3) Ti-плазмиды имеют большую длину, а для экспериментов с рекомбинантной ДНК нужны векторы меньшей длины, поэтому участки ДНК, несущественные для клонируемого вектора должны быть удалены.

4) Ti-плазмиды не реплицируются в E. Coli, что исключает работу с рекомбинантными Ti-плазмидами в этих бактериях.

В настоящее время на основе Ti-плазмиды были сконструированы коинтегративный и бинарный векторы, которые реплицируются в клетках кишечной палочки.

Коинтегративный (промежуточный) вектор создан на основе плазмидного вектора E. coli (например, рВR322) и содержит:

- ori-сайт – точку начала репликации в E. coli;

- маркерный ген, транскрибирующийся либо в E. coli, либо в агробактерии;

- правую флангирующую последовательность Т-ДНК;

- маркерный ген, транскрибирующийся в растительной клетке;

- донорный ген (Х), который нужно ввести в растительный геном;

- фрагмент Ti-плазмиды.

С помощью коньюгации такой клонирующий коинтегративный вектор из клеток E. coli переносят в клетки специальных штаммов A. tumefaciens, которые содержат другой вектор – неонкогенную Ti-плазмиду. Этот вектор несет гены, способные обеспечить транспорт и интеграцию Т-области в геном растений.

Неонкогенная Ti-плазмида-помощник содержит:

- ori-сайт – точку начала репликации в A. tumefaciens;

- левую флангирующую последовательность Т-ДНК;

- vir-область.

Происходит рекомбинация между гомологичными участками Т-ДНК коинтегративного и неонкогенного векторов, и образуется единая рекомбинантная Ti-плазмида, которая несет интересующий исследователя ген (Х) и растительный маркерный ген, правую и левую флангирующие последовательности Т-ДНК.

Недостатком коинтегративной векторной системы является то, что она применима для трансформации только некоторых видов растений.

Бинарная векторная система, по сравнению с коинтегративной, состоит из двух векторов, которые одновременно находятся в клетке агробактерии, и не объединяются в единую векторную молекулу. Один из векторов содержит Т-ДНК, а другой – vir-область. Обе эти плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут трансформировать растительную клетку.

Один вектор, так называемый клонирующий (челночный), содержит:

- сайты инициации репликации в E. coliи вA. tumefaciens;

- маркерные гены, транскрибирующиеся в клетке растений, в E. coliи A. tumefaciens;

- правую и левую флангирующие последовательности Т-ДНК;

- донорный ген (Х), но не несет генов vir-области.

Все стадии клонирования проводят в E. сoli, что намного упрощает весь процесс, а затем вектор вводят в клетки агробактерии, в которых содержится неонкогенная Ti-плазмида, состоящая из сайта инициации репликации вA. tumefaciens и vir-области. Белки, экспрессируемые генами vir-области неонкогенной Ti-плазмиды, вырезают область Т-ДНК из челночного вектора и встраивают ее в геном растительной клетки. Такие бинарные векторные системы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток.

В настоящее время наряду с Ti-плазмидой в генетической инженерии широко используются векторы на основе Ri-плазмид, которые выделены из агробактерии Agrobacterium rhizogenes. Ri-плазмиды вызывают усиленное избыточное образование корней, и также, как Ti-плазмиды, приводят к синтезу опинов. Преимущество Ri-плазмид состоит в их неонкогенности, что позволяет регенерировать из трансформированных ею клеток здоровые растения. Кроме того, Ri-плазмида может принести пользу растению, способствуя корнеобразованию. Так, трансформированный Ri-плазмидой картофель, отличается большей развитостью корневой системы, засухоустойчивостью и повышенной урожайностью.

Векторы на основе ДНК-содержащих вирусов растений обладают рядом преимуществ по сравнению с плазмидными векторными системами:

Ø малый размер генома, что позволяет легко манипулировать вирусной ДНК;

Ø высокая копийность вирусной ДНК в клетках зараженных растений;

Ø наличие сильных промоторов, которые могут обеспечить эффективную экспрессию чужеродных генов.

В генетической инженерии растений наиболее перспективным в качестве вектора считается вирус мозаики цветной капусты, поражающий в основном растения семейства крестоцветных. Этот вирус обладает всеми преимуществами векторов для растений. Вводят его в растения путем втирания в листья. Инфицирование небольшого числа клеток приводит к заражению всего растения, так как вирус распространяется от клетки к клетке. Использование 1-5 мкг ДНК является достаточным для почти 100%-ного инфицирования одного растения, что значительно выше, чем при агробактериальном заражении.

Однако вирусы, в том числе и вирус мозаики цветной капусты, имеют ряд недостатков:

Ø не интегрируются с ДНК растения;

Ø патогенны;

Ø имеют небольшую емкость (800-1000 п.н.);

Ø ограниченный круг хозяев.

Некоторые из этих проблем сейчас решены для вируса мозаики цветной капусты. Работы в данном направлении продолжаются.

Методы трансформации растительных клеток различаются в зависимости от трансформируемого объекта (однодольные или двудольные растения). Одним из самых распространенных методов получения трансгенных двудольных растений является метод кокультивирования с агробактерией. Этот метод основан на трансформации клеток растений агробактериями, несущими векторную конструкцию (бинарную, коинтегративную и др.). Популярность этого метода связана с относительной простотой проведения трансформации и довольно высоким выходом трансгенных растений – 10-60% в зависимости от вида. Методом кокультивации с агробактерией к настоящему времени получены трансгенные растения практически у всех сельскохозяйственных двудольных растений. Этот метод применим также и для некоторых однодольных растений, таких как пшеница, кукуруза, рис.

Для трансформации однодольных растений разработан ряд методов, которые могут быть применены и для двудольных растений, в частности методы прямого переноса генов в растительные клетки:

1) Метод трансформации протопластов растений основан на введении в протопласты практически любого ДНК-вектора, несущего чужеродный ген. В этом состоит преимущество этого метода. Однако могут быть использованы протопласты только тех клеток, из которых можно регенерировать растения.

2) Метод микроинъекции ДНК обладает рядом преимуществ. При этом методе трансформации может быть использован любой тип вектора. Трансформация не является видоспецифичной. Эффективность трансформации составляет 10-15% независимо от типа вектора. Недостатком метода является то, что можно одновременно сделать инъекцию только в одну клетку.

3) Метод электропорации основан на повышении проницаемости плазмалеммы протопластов для чужеродной ДНК за счет действия импульсов высокого напряжения. Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения.

4) Метод упаковки в липосомы основан на введении чужеродной ДНК в составе липосом в протопласты растений. Липосомы представляют собой сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. Липосомы создаются искусственно путем встряхивания или обработки ультразвуком водных эмульсий фосфолипидов. С помощью этого метода в протопласты растений можно ввести практически любую векторную систему и даже целые метафазные хромосомы. Преимущества этого метода: низкая токсичность липосом по отношению к клеткам и высокая восприимчивость многих видов растений. Недостатки метода: низкая трансформирующая активность (0,5-1%), техническая сложность и могут быть использованы протопласты только тех клеток, из которых можно регенерировать растения.

Метод биобаллистической трансформации основан на бомбардировке микрочастицами из золота, вольфрама и платины с напыленными векторными ДНК или чужеродными ДНК культивируемых клеток растений. Попав в клетку, ДНК, покрывающая частицы, интегрируется в растительную ДНК. Этот метод применим для трансформации широкого круга растений, как однодольных, так и двудольных, прост в использовании. На сегодняшний день используется очень широко, в том числе и для транспортировки генов в хлоропласты и митохондрии.