Выделение чистой культуры аэробных бактерий

Выделение микроорганизмов из различных материалов и получение чистых культур широко используется в лабораторной практике для микробиологической диагностики инфекционных заболеваний.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида, полученная в изолированном состоянии (например, на питательной среде).

Выделение чистой культуры аэробных бактерий достигается механическим разобщением исследуемого материала при посеве на питательные среды в присутствии кислорода.

Луи Пастер предложил для этой цели последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде, однако выделить чистую культуру этим методом очень сложно, так как при этом требуется очень большое количество разведений.

Проблему выделения чистых культур решил Роберт Кох. Он предложил исследуемый материал разводить в пробирках с расплавленным и остуженным до температуры 45–50 °С МПА (количество разведений зависит от исходной обсемененности материала.). Затем содержимое каждой пробирки выливают в стерильную чашку Петри, после затвердевания МПА чашки помещают в термостат. На следующий день посевы изучают. Отбирают подозрительные колонии, изучают их макроскопически (визуально) и микроскопически в окрашенных препаратах с помощью микроскопа. Далее производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА. На следующий день проверяют чистоту выделенной культуры визуально и микроскопически. В настоящее время метод Коха применяют, в основном, для подсчета количества микробов в исследуемом материале.

В практических лабораториях обычно для выделения чистых культур используется метод Дригальского – поверхностный последовательный рассев исследуемого материала бактериологической петлёй (рисунок 18) или шпателем (рисунок 19 ) на три чашки с МПА. Процесс выделения чистой культуры можно разделить на несколько этапов.

Материал направляют в бактериологическую лабораторию с направлением, в котором указан предполагаемый диагноз.

Рис. 18 Бактериологическая петля

Рис.19 Шпатель

Первый этап. Из исследуемого материала готовят мазок, окрашивают по Граму или другим методом (в зависимости от предполагаемого диагноза) и микроскопируют.

Далее производят посев материала на три чашки Петри с питательной средой последовательно. Материал забирают бактериальной петлёй и наносят на поверхность питательной среды в первой чашке Петри, растирают круговыми движениями шпателем на поверхности среды, затем повторяют процедуру на поверхности среды во второй чашке и на поверхности среды в третьей. Чашки подписывают на донышке, ставят вверх дном в термостат и инкубируют посевы при температуре 37 °С в течение 18–24 часов или при других параметрах с учетом культуральных свойств предполагаемого возбудителя (рисунок 20).

Второй этап. На следующий день посевы просматривают и отбирают «подозрительные» колонии. «Подозрительными» являются колонии предполагаемого возбудителя. Изучают морфологию бактерий исследуемых колоний путем приготовления мазка, окрашенного по методу Грама (или другим методом в зависимости от свойств предполагаемого возбудителя). При обнаружении в мазке бактерий, имеющих морфологические и тинкториальные свойства предполагаемого возбудителя, производят пересев колонии в пробирку со скошенным МПА для выделения и накопления чистой культуры. Пробирки подписывают и помещают в термостат при температуре 37 °С на 18–24 часа.

Рис. 20 Термостат

Третий этап. На следующий день отмечают характер роста выделенной чистой культуры. Проводят макроскопическое (визуальное) исследование посевов (рисунок 21). Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом (колонии должны быть однотипными). Далее проводят микроскопическое изучение культуры. При обнаружении в мазке морфологически и тинкториально однородных клеток, делают вывод о получении чистой культуры и продолжают исследование. Изучают биохимические, антигенные и патогенные свойства бактерий для идентификации выделенной культуры, то есть определения вида, а иногда продолжают исследование: проводят внутривидовую идентификацию для определения биовара, серовара или фаговара.

Рис.21 Макроскопическое изучение и роста выделенной чистой культуры

Для выделения чистой культуры используют также метод посева исследуемого материала петлей по секторам(рисунок 22). Для этого питательную среду в чашке Петри делят на несколько секторов (4–5), проводя линии карандашом по стеклу на дне чашки. Забирают материал стерильной и остуженной бактериологической петлей и производят посев штрихом последовательно на каждый сектор среды.